Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount <em>Drosophila</em> Embryos for Super-Resolution Imaging

Samia Parveen; Nicolas W. Jones; Ian Millerschultz; Adam C. Par&#233;

doi:10.3791/64662

استخدام الفحص المجهري التوسعي لتكبير أجنة ذبابة الفاكهة المثبتة بالكامل جسديا للحصول على...

JoVE Journal
Developmental Biology
Author Produced

This content is Free Access.

JoVE Journal Developmental Biology

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

استخدام الفحص المجهري التوسعي لتكبير أجنة ذبابة الفاكهة المثبتة بالكامل جسديا للحصول على تصوير فائق الدقة

Full Text

2,764 Views

09:11 min

April 28, 2023

DOI: 10.3791/64662-v

Samia Parveen¹, Nicolas W. Jones¹, Ian Millerschultz¹, Adam C. Paré¹

¹Department of Biological Sciences,University of Arkansas

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This article presents a protocol for implementing expansion microscopy in early Drosophila embryos, enabling super-resolution imaging with a conventional laser-scanning confocal microscope. This technique allows researchers to bypass the diffraction limit of standard microscopy by expanding the sample itself.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Developmental Biology
Imaging Techniques

Background

Expansion microscopy enhances imaging resolution.
It is particularly useful for studying protein localization in embryos.
The protocol is designed for labs without access to super-resolution microscopes.
Common challenges include embryo loss during the procedure.

Purpose of Study

To provide a detailed protocol for expansion microscopy in Drosophila embryos.
To facilitate super-resolution imaging for researchers in developmental biology.
To improve understanding of protein localization and its effects on cell morphology.

Methods Used

Preparation of agar slabs for embryo adherence.
Use of Poly-L-Lysine for embryo fixation.
Gelation of PDMS for hydrogel formation.
Imaging with a laser scanning confocal microscope.

Main Results

Successful implementation of the expansion microscopy protocol.
High-resolution images of protein localization in embryos.
Demonstration of the technique's effectiveness in bypassing diffraction limits.
Identification of best practices to minimize embryo loss.

Conclusions

The protocol enables researchers to achieve super-resolution imaging without specialized equipment.
It is a valuable tool for studying complex subcellular structures in embryos.
Future applications may enhance our understanding of developmental processes.

Frequently Asked Questions

What is expansion microscopy?

Expansion microscopy is a technique that allows researchers to achieve super-resolution imaging by physically expanding the sample.

What organisms can this protocol be applied to?

This protocol is specifically designed for early Drosophila embryos.

What are the main challenges in this protocol?

The most common challenge is losing embryos during the procedure, which can be mitigated by proper adherence techniques.

How does this technique compare to traditional microscopy?

This technique allows for higher resolution imaging by overcoming the diffraction limit of conventional microscopes.

What is the role of Poly-L-Lysine in this protocol?

Poly-L-Lysine is used to adhere and fix embryos to the agar slabs for imaging.

How long does the gelation process take?

The gelation process typically takes between 1.5 to 2.5 hours at 37 degrees Celsius.

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتنفيذ الفحص المجهري التوسعي في أجنة ذبابة الفاكهة المبكرة لتحقيق تصوير فائق الدقة باستخدام مجهر متحد البؤر تقليدي للمسح بالليزر.

يمكن تنفيذ هذا البروتوكول في معظم مختبرات البيولوجيا التنموية للمريء ، مما يسمح للباحثين الذين ليس لديهم إمكانية الوصول إلى المجاهر فائقة الدقة بإنتاج صور فائقة الدقة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للباحثين بتجاوز حد الحيود للمجهر التقليدي متحد البؤر دون الحاجة إلى مجهر فائق الدقة عن طريق توسيع العينة نفسها. سيكون هذا البروتوكول مفيدا لأولئك الذين يدرسون كيفية تأثير توطين البروتين على مورفولوجيا الخلية أو وظيفتها في الأجنة السليمة ، خاصة عندما يتم تنظيم هذه البروتينات في هياكل أو شبكات تحت خلوية معقدة.

المشكلة الأكثر شيوعا التي يواجهها الناس هي فقدان الأجنة في جميع أنحاء البروتوكول. ينصح بتطبيق طبقات متعددة من Poly-L-Lysine للالتصاق بالأجنة بإحكام. بعد الأجنة ، خذ قاعدة طبق بتري بلاستيكية بطول ستة سنتيمترات مملوءة نصفها ب 3٪ أجار.

سجل مستطيلا خمسة في ثلاثة سنتيمترات في أجار بشفرة حلاقة أو مشرط. قم بإزالة لوح أجار باستخدام ملعقة مختبر صغيرة. ثم اقلب قاعدة طبق بتري ، وضعه على المقعد ، وضع لوح أجار أعلى الطبق المقلوب.

أخرج الغطاء من طبق بتري وتأكد من جفافه. باستخدام القفازات ، ضع قطعة من الشريط على الوجهين داخل الغطاء. أخرج القوارير التي تحتوي على الأجنة المطلية والثابتة من شاكر وضعها عموديا على طاولة العمل.

اسمح للمراحل العضوية والمائية بالانفصال. يجب أن تظل الأجنة الثابتة بشكل صحيح في واجهتها. قم بإزالة المرحلة المائية السفلية تماما باستخدام ماصة باستور وماصة P200.

استخدم ماصة باستور الزجاجية المزودة بمصباح لاتكس لنقل الأجنة المثبتة على لوح أجار على دفعات صغيرة متعددة حتى لا تلتصق بداخل الماصة. بمجرد أن تصبح الأجنة على لوح الآجار ، استخدم أنبوب P200 لإزالة أي هيبتان متبقي بالقرب من الأجنة. الآن ، أسقط غطاء الشريط على الوجهين على لوح الآجار من ارتفاع سنتيمترين للصق الأجنة بالشريط.

قم بإزالة الغطاء برفق من لوح أجار ، وضعه رأسا على عقب على المقعد ، وأضف ما يكفي من PBS Tween لتغطية الأجنة في الغطاء. لجمع الأجنة المطلوبة ، استخدم مجهر تشريح ستيريو بتكبير 100x مع إضاءة غير مباشرة. وخز الغشاء الزجاجي بالقرب من الطرف الأمامي أو الخلفي للجنين بإبرة زجاجية دقيقة لتفريغه وتحرير الضغط.

استخدم ملقط رفيعا أو مسبارا معدنيا لدفع الجنين برفق للخارج من خلال الفتحة مع استمرار تمسك غشاء vitelline بالشريط على الوجهين. اترك الأجنة غير المرغوب فيها على الشريط. استخدم بشكل دوري ماصة باستور الزجاجية لجمع أي جنين عائم ونقله إلى أنبوب ميكروفوج سعة 1.5 ملليلتر.

قم بإعداد محلول PDMS في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر وإنشاء أنبوب متوازن عن طريق إضافة كمية مناسبة من الماء إلى أنبوب مخروطي ثان سعة 50 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي حل PDMS عند 500G لمدة ثلاث دقائق عند 15 درجة مئوية. ثم اسكبه في طبق بتري 10 سم على عمق ملليمتر واحد.

اسمح لمحلول PDMS بالتصلب طوال الليل عند 55 درجة مئوية. بمجرد أن يتم تثبيت لوح PDMS ، قم بتسجيل مساحات مربعة أصغر قليلا من انزلاق غطاء 22 × 22 مم باستخدام مشرط. داخل كل مربع ، سجل وأزل بئرا مربعا بعرض ثمانية ملليمترات.

انقل كل PDMS مربع جيدا على غطاء 22 × 22 ملم وألصقه بإحكام. للصق الأجنة بزلات الغطاء ، ضع ما يكفي من 0.1٪ Poly-L-Lysine لتغطية سطح انزلاق الغطاء داخل كل بئر ووضعها في حاضنة 55 درجة مئوية حتى تجف. شطف لفترة وجيزة الأجنة و PBS لإزالة منظف Tween.

ثم انقل أكثر من 10 أجنة إلى كل بئر مطلي ب Poly-L-Lysine. اسمح للأجنة بالاستقرار في قاع الآبار. قم بإزالة السائل الزائد من الأجنة الملتصقة باستخدام ماصة باستور وانتقل فورا إلى الخطوة التالية.

بينما تجلس الأجنة في محلول المونومر ، قم بإعداد محلول الهلام لتغطية آبار PDMS. تمييع المؤكسد الحفاز طازجا من مسحوق. اجمع بين 3،920 ميكرولتر من محلول المونومر مع 60 ميكرولتر من 10٪ TEMED و 20 ميكرولتر من 1٪ TEMPO.

قم بتقسيم محلول الهلام إلى حصص 125 ميكرولتر إلى أنابيب PCR متعددة. قم بإزالة محلول المونومر من آبار PDMS باستخدام فراغ أو أنبوب مع الحرص على عدم تعطيل الأجنة. أضف خمسة ميكرولترات من APS إلى أحد أنابيب PCR التي تحتوي على محلول الهلام لبدء البلمرة.

قم بتوزيع محلول البلمرة بسرعة بين الآبار الثلاثة. كرر هذا حتى يتم تغطية جميع الآبار والأجنة. دع العينات تتكاثر لمدة 1.5 إلى 2.5 ساعة عند 37 درجة مئوية.

سوف تستغرق الهلاميات المائية السميكة وقتا أطول لإكمال البلمرة والتصلب. تحريك الهلاميات المائية في كثير من الأحيان لمراقبة البلمرة. بمجرد التصلب ، لن تذبذب الهلاميات المائية.

بعد الهلام ، قشر آبار PDMS من انزلاق الغطاء دون إزعاج الهلاميات المائية. نقل الهلاميات المائية بشكل فردي إلى آبار لوحة ستة آبار. قد تتوسع الهلاميات المائية قليلا أثناء الهضم.

تغطية المواد الهلامية تماما مع العازلة الهضم. 30 ملليلتر من محلول الهضم يكفي لتغطيتها في صفيحة ستة آبار واحتضانها لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد الهضم ، انقل الهلاميات المائية إلى طبق بتري طوله ستة سنتيمترات واملأه بالماء منزوع الأيونات للتمدد.

قد تنفصل الهلاميات المائية عن انزلاقات الغطاء عند هذه النقطة وتتوسع أربع طيات في البعد الخطي. باستخدام ماصة باستور ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الماء الزائد من طبق بتري لتقليل حركة المواد الهلامية عند التعامل معها. قم بمناورة المواد الهلامية الموسعة مع الأجنة على السطح السفلي على زلة غطاء كبيرة للتصوير.

قم بتركيب كل غطاء بجل فوق هدف مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر المقلوب. بعد تحديد موقع العينات التي تم تنظيمها وتوجيهها بشكل صحيح ، تحولت إلى زيت عالي التكبير أو هدف غمر في الماء إلى صورة بدقة عالية. أظهر قياس طول الجنين على طول محور الرأس إلى الذيل تحت هدف 10x أن الأجنة غير الموسعة امتدت ما يقرب من نصف مجال الرؤية ، في حين أن الأجنة الموسعة امتدت تقريبا إلى مجالين كاملين للرؤية.

كان متوسط طول الرأس إلى الذيل للأجنة الضابطة غير الموسعة 398.8 ميكرومتر. بالنسبة للتجارب الأولى والثانية والثالثة، كان متوسط أطوال الجنين هو 4.0 أضعاف و4.7 أضعاف و4.9 أضعاف على الترتيب. في عينة التحكم ، كان متوسط عرض الخلايا في الجزء الفكي العلوي 4.76 ميكرومتر.

في العينات الموسعة ، كان متوسط عرض الخلايا في الجزء الفكي العلوي 19.10 ميكرومتر ، وهو ما يمثل توسعا بمقدار 4.0 أضعاف. تم تصوير الهيكل الخلوي actomyosin في السيطرة غير الموسعة مقابل الأجنة الموسعة ، التي تخضع لتمديد متقارب. ظهرت كخط واحد حيث التقت الخلايا المجاورة.

على النقيض من ذلك، في المرحلة السابعة الموسعة من الأجنة، يمكن ملاحظة خطوط متوازية من الميوسين اثنين عند تقاطعات الخلايا الخلوية، وهو ما يمثل تجمعات البروتين القشري في الخلايا المجاورة. في المرحلة السادسة من الأجنة غير الموسعة ، ظهرت الميتوكوندريا الموصوفة بالستربتافيدين كضباب سيتوبلازمي غير متجانس دون أي تفاصيل واضحة تحت الخلية. ومع ذلك ، في الأجنة الموسعة ، كانت العديد من النقاط قابلة للحل داخل السيتوبلازم ، ومن المحتمل أن تمثل الميتوكوندريا المجزأة أو أجزاء من شبكة الميتوكوندريا.

أحد الأشياء المهمة التي يجب تذكرها عند محاولة هذا الإجراء هو حماية الأجنة من التعرض المفرط للضوء بعد حضانة الأجسام المضادة الثانوية.