جرحشاعثزرحشرتاد الإسفار عن التصوير المقطعي في الجسم الحي. تصوير النامية ذبابة الفاكهة

من أجل إجراء إعادة بناء الأعضاء النامية داخل ذبابة الفاكهة السوداء ، نحتاج إلى تحديد النموذج الأمامي الذي يصف انتشار الضوء داخل الخادرة نفسها بشكل أفضل. يبدأ الإجراء باختيار خادرة بيضاء قبل الخادرة ولصقها في نهاية أنبوب شعري بحيث يتم توجيه المحور الخلفي الأمامي للبوبا بالتوازي مع الأنبوب. يمتلئ أنبوب شعري صغير ببعض الصبغة الفلورية ويتم إدخاله في علبة التلميذ.

بعد ضبط المحور الدقيق ، يتم تدوير الخادرة 360 درجة. يتم الحصول على الصور من زوايا مختلفة. تستخدم بيانات الإضاءة العابرة الفلورية المكتسبة لتحديد النموذج الأمامي الذي سيتم استخدامه لتصوير تطور الأعضاء.

مرحبا ، اسمي كلوديا وأنا في مركز علم الأحياء المساعدة في مستشفى ماساتشوستس العام ، كلية الطب بجامعة هارفارد. أنا أولا بيتو من مختبر باراماونت في كلية الطب بجامعة هارفارد ، وأنا دانيال روزانسكي من معهد التصوير البيولوجي والطبي في الجامعة التقنية في ميونيخ ومركز هيليمان في ميونيخ. سنعرض لك اليوم إجراء لإعادة بناء الجسم كله ثلاثي الأبعاد في Oph Melano Casta.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا للتصور في الجسم الحي لتطوير الأعضاء أثناء حالة التلميذ. لذلك دعونا نبدأ قبل البدء. يرجى ملاحظة أنه لا يوجد مقطع فيديو مصاحب يجب مشاهدته قبل هذا الفيديو ، حيث يتم شرح بعض الجوانب الفنية للتصوير المقطعي البصري بتفصيل أكبر مما هو عليه هنا.

بالإضافة إلى ذلك ، يشرح الفيديو الآخر تصوير الأنسجة المحضرة أو أعضاء الكبيرة. لجميع التجارب التي يغطيها هذا الفيديو ، سيتم استخدام جينات ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا. هم EL A غال أربعة معبرا عنها في الغدد اللعابية ، apteris gal four ، والتي يتم التعبير عنها في أنسجة سلائف اليرقات للجناح البالغ والصدر ، الجين المعدل الذي يصنع بروتين الفلورسنت.

ردا على غال أربعة يسمى U-A-S-G-F-P و white 1118 ، يتم عبور الذكور غير الفلورية الذين يحملون الجينات المعدلة وراثيا UAS إلى الإناث البكر اللواتي يحملن الجينات المعدلة وراثيا GAL الأربعة لتحقيق الأنسجة. يتم إعداد تعبير محدد عن صلبان GFP من ثمانية إلى 10 إناث وذكور عذراء على وسائط ذبابة قياسية مع رش خميرة الخباز. على السطح ، توجد القوارير عند 25 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحت دورة مظلمة فاتحة مدتها 12 ساعة.

بعد يومين من بدء الصليب ، يتم نقل الوالدين إلى قارورة جديدة وبعد خمسة إلى ستة أيام ، ستبدأ PUI في ملء القارورة البيضاء PrepU. تم اختياري للتعبير عن GFP تحت نطاق تشريح الفلورسنت. يضمن اختيار اللون الأبيض قبل البوي التدريج المناسب للحيوانات لأنها تظل بيضاء لمدة ساعة تقريبا.

بعد التلميذ ، تصبح مصطبغة أو بنية اللون. يتم جمع GFP الذي يعبر عن pui برفق من القوارير باستخدام فرشاة رسم مبللة ويوضع في قطرة ماء أو PBS في طبق بتري ، ويجب مسح الشراء نظيفا من المواد الفلورية الذاتية. باستخدام فرشاة الرسم ، يجب أن يكونوا الآن جاهزين للتصوير المقطعي.

إذا كانت PrepU أحتاج إلى مواصلة الشيخوخة للوصول إلى مرحلة النمو الصحيحة ، فيمكن تركها في طبق بتري بمنشفة ورقية مبللة أو في قارورة طعام نظيفة. سيضمن ذلك الرطوبة الكافية والتطور المناسب للتصوير. يجب أن تلتصق PrepU بالجزء الداخلي من أنبوب شعري زجاجي بقطر 800 ميكرون.

قم بطلاء الطرف الخلفي من التلميذ بالغراء الفائق ، وقم بتوجيه السطح اللاصق للخادرة المسبقة في الأنبوب بحيث يكون الوصول الخلفي الأمامي للذبابة موازيا للأنبوب. الجزء الأمامي من سوف يتدلى من الأنبوب الشعري. يتم الآن تثبيت الأنبوب الشعري على المرحلة الدورانية للمجهر.

في الوضع الرأسي ، اضبط محور الإمالة لمرحلة الدوران بحيث يكون المحور الدوراني للأنبوب بالتوازي مع أعمدة البكسل في CCD التصوير. مع تعديل موضع الذبابة ، تابع التصوير. في هذا المثال ، يجب تصوير ذات الغدد اللعابية الفلورية بحيث يمكن إنشاء GFP في الغدد اللعابية من خليط بين مخزونات EAG four و U-A-S-G-F-P.

نبدأ بخادرة مسبقة مثبتة ، وتضيء الخادرة المسبقة بشعاع إثارة ونجمع إشارة الفلورسنت GFP. في الإضاءة الانتقالية ، قم بتدوير PrepU 360 درجة على طول محوره الرأسي واحصل على صور الإضاءة العابرة. كل صورة تتوافق مع 10 درجات من الدوران.

يعتمد إجمالي وقت الاستحواذ على مقدار التألق وعلى شدة شعاع الإثارة. الأوقات النموذجية في ترتيب دقيقة واحدة. في هذا المثال، سيتم تصوير خادرة DSO التي تعبر عن GFP في الأقراص الخيالية للجناح.

يمكن جمع هذه الخادرة من قارورة صليب بين مخزون Aus GAL four و U-A-S-G-F-P. يتم تركيب الخادرة المسبقة كما هو موضح سابقا. ومع ذلك ، نظرا لأن وقت التصوير لهذه التجربة يبلغ حوالي ثماني ساعات ، فمن الأهمية بمكان أن تظل البيئة رطبة وفي درجة حرارة الغرفة لتجنب الجفاف وموت ، يتم وضع مصراع فوق شعاع الإثارة لمنع تبريد أربعة الأزهار في الأنسجة ذات الأهمية ، وكذلك لضمان عدم حرق بواسطة شعاع الليزر كما كان من قبل ، تضيء بشعاع الإثارة واجمع إشارة الفلورسنت GFP عن طريق الإضاءة العابرة.

يتم تدوير الخادرة المسبقة بالكامل على طول محورها الرأسي. أثناء جمع البيانات ، يستغرق الدوران دقيقة واحدة فقط ويتم تكراره على فترات زمنية مختلفة. لإنشاء سلسلة من الصور ذات الفاصل الزمني للأجنحة أثناء التطوير ، يمكن الحصول على البيانات لمدة ست ساعات على الأقل بمعدل 100 صورة في الساعة.

من الضروري التحكم في التعرض الكلي للضوء باستخدام هذا الغالق لمنع الضرر أو تبييض الصورة. يعرض هذا الفيلم صورا تم الحصول عليها بين مرحلة PrepU ونفور رأس التلميذ. عند إعادة بناء الصورة ثلاثية الأبعاد ، هناك تشتت أمامي قوي يجب حسابه ، والذي لا يمكن تقريبه عن طريق الانتشار.

لذلك لجعل إعادة الإعمار نموذجا تشتت أماميا لانتشار الضوء يجب تحديده من أجل البساطة ، فإننا نهمل الامتصاص. يتم اختبار كمية التشتت تجريبيا. للقيام بذلك ، يتم إدخال جسم غريب ذو مضان قياسي في الخادرة البيضاء غير الفلورية 1118 ، والتي يتم مسحها ضوئيا بعد ذلك لإنشاء بيانات النموذج الأمامية بدءا من ملء أنبوب شعري من السيليكا 100 ميكرون بصبغة فلورسنت PS 5.5.

باستخدام الحركة الشعرية ، ادفع الأنبوب الشعري إلى الخادرة بزاوية 45 درجة على المحور الأمامي ، وقم بتركيب PrepU في أنبوب شعري وضعه بشكل مناسب على مرحلة الدوران كما هو موضح سابقا. الآن قم بإضاءة الخادرة المسبقة بشعاع ليزر إثارة مع عدسة ذات فتحة عددية منخفضة وجمع صور الإضاءة العابرة الفلورية للخادرة السابقة. كما هو موضح سابقا ، يتم استخدام برنامج MATLAB لملاءمة البيانات في النموذج النظري الصريح الأمامي لتسهيل عملية إعادة البناء ، يتم تحديد التقريب الثابت لمعادلة النقل لأنه يصف نظام التشتت الأمامي ويناسب أيضا البيانات التجريبية.

بعد تحديد النموذج الأمامي الصحيح ، يمكننا إعادة بناء الغدد اللعابية والحصول على إعادة البناء المقطعي بفاصل زمني. إذا كنت تخطط لاستخدام التصوير المقطعي للمساحة الحرة، فيمكن أيضا إعداد خوارزميات التكوين لمطابقة الفهرس. أولا ، نعرض إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للغدد اللعابية في وقت مبكر من التطور.

للمقارنة ، يظهر التلوين النسيجي للغدد اللعابية أن عمليات إعادة البناء ترتبط ارتباطا جيدا بالأنسجة. تم الحصول على فيلم الفاصل الزمني هذا لتطوير الأقراص الخيالية للجناح من عينة حية واحدة. للمقارنة تلطيخ نسيجية من الجناح قرص [أت ث سم تيم] نقاط يبدي أن إعادة البناء يرتبط جيدا مع الأنسجة.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية بناء نظام لتصوير الهياكل ثلاثية الأبعاد داخل oph في الجسم الحي ، وبمرور الوقت. هذا يسمح بمتابعتنا ، التشكل في ذبابة الفاكهة ، ومتابعة تطور الأجنحة على مدار ست ساعات متتالية. عند القيام بهذا الإجراء ، من الضروري اختيار النموذج الأمامي الصحيح لانتشار الضوء داخل ذبابة الفاكهة.

يمكن استخدام هذه الطريقة جنبا إلى جنب مع التقنيات النسيجية لتسليط الضوء على نمو الأعضاء خلال مراحل التلميذ ، ويمكن تعديلها لدراسة الكائنات الحية المختلفة ذات الحجم المماثل. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.