زرع قنية داخل الجمجمة لمستقبلات المستضد الخيمري التسلسلي (CAR) في الخلايا التائية في الفئران
February 24th, 2023
أورام الجهاز العصبي المركزي (CNS) هي السبب الرئيسي للوفاة المرتبطة بالسرطان لدى الأطفال ، ويتم اختبار العلاجات القائمة على المناعة المحلية بشكل متزايد للمرضى في التجارب السريرية. يصف هذا البروتوكول طرق زرع القنية الموضعية في الفئران للتقييم قبل السريري للدفعات المناعية التي تستهدف أورام الجهاز العصبي المركزي.
يكرر هذا البروتوكول نظام القسطرة داخل البطيني المستخدم في التجارب السريرية الجارية لاختبار التسليم الإقليمي المحلي للعلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية الموجه ضد أورام الجهاز العصبي المركزي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على توفير جرعات متكررة متعددة من العلاج بالخلايا التائية CAR T الإقليمية المحلية دون إجراء عمليات جراحية متعددة الغازية. يمكن استخدام هذا النظام للتحقيق في العلاجات المختلفة في مواقع التسليم المختلفة ، وبالتالي قد يوفر نظرة ثاقبة لعدد لا يحصى من مجالات البحث في علم الأعصاب.
للبدء ، ضع الماوس المخدر برأس محلوق على طاولة العمليات وافتح الجزء السفلي من الذراع التجسيمي برفق باستخدام ملعقة. أدخل القنية بالملقط وقم بتثبيتها عن طريق شد المسمار على الذراع حتى يبرز نصف إلى ثلثي الجزء البلاستيكي الأبيض وخمسة ملليمترات من القنية من أسفل الفتحة. أدخل وثبت الأسنان العلوية للفأر في شريط العضة لجهاز التجسيم.
اسحب مخروط الأنف للأمام وشده ، مع التأكد من أن الماوس يستنشق الأيزوفلوران. ثم ، قم بتركيب الماوس على جهاز التجسيم الدافئ باستخدام أصفاد الأذن أو قضبان الأذن ، وتجنب الضغط المفرط. تطهير موقع الجراحة وجعل قطع موازية للجمجمة كما هو موضح في المخطوطة.
استخدم مسحات طرف القطن لدفع اللفافة بعيدا. تحديد المعالم ، bregma و lambda على الجمجمة المقابلة للعلامات الأمامية والخلفية حيث تلتقي لوحات الجمجمة. لإنشاء سطح لربط الأكريليك ، قم بعمل عدة شقوق برفق عبر الجمجمة باستخدام مشرط.
باستخدام الذراع المجسمة ، قم بتوطين القنية إلى المعلم محل الاهتمام. ارفع طرف القنية من واحد إلى ملليمترين فوق سطح الجمجمة وانتقل إلى الإحداثيات المطلوبة. باستخدام إبرة قياس 18 أو مثقاب جراحي ، قم بعمل فتحتين لولبيتين على الجمجمة المكشوفة بعيدا عن مكان دخول القنية ، مما يضمن مساحة كافية للقنية.
تحريف الحفر من خلال ثقب المسمار حتى يعلق على الجمجمة. باستخدام مفك براغي ذو طرف مسطح ، أدخل واربط مسمارين في الفتحات. ثم اسحب المسمار لأعلى برفق للتأكد من تثبيته.
لإدخال قنية ، قم بإنشاء ثقب في الجمجمة عند الإحداثيات المحددة باستخدام إبرة قياس 18 أو مثقاب جراحي. باستخدام ذراع التوضيع التجسيمي ، اخفض القنية إلى إحداثيات DV المطلوبة. في حوالي 0.3 جرام من مسحوق راتنج الأكريليك و 10 إلى 15 قطرة من السائل في صفيحة خزفية ذات 12 بئرا ، قم بتحميل المادة البيضاء اللزجة المحضرة في حقنة سعة ملليلتر واحد.
معطف الجمجمة وملء الفراغات حول القنية والمسمار. قم بفك المسمار الموجود على ذراع التوضيع التجسيمي بينما يكون الأسمنت مرنا. استخدم ملعقة برفق لتحرير القنية من الحامل عند الفتحة السفلية واسحب ذراع التوضيع التجسيمي بعيدا عن الماوس.
بمجرد تجفيف الأسمنت ، أدخل القنية الوهمية في قنية التوجيه وقم بتدويرها في اتجاه عقارب الساعة لتثبيتها بإحكام. بمجرد اكتمال الإجراء ، أعد الماوس إلى قفصه المنزلي الدافئ للتعافي. لتحضير قنية العلاج ، أدخل الجزء العلوي منها في أنبوب PKG.
بعد ذلك ، املأ حقنة العلاج بتعليق الخلايا التائية CAR T وأدخلها من خلال الطرف الآخر من أنبوب PKG ، الذي يغطي الجزء العلوي من قنية العلاج. بعد تخدير الماوس ، قم بتثبيت قنية التوجيه في القاعدة باستخدام ملقط. قم بفك وإزالة القنية الوهمية ، مما يسمح بالوصول إلى قنية التوجيه.
نقع الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية لمدة دقيقة واحدة وثبت قنية العلاج في مكانها لمدة دقيقة إضافية. بعد إزالة قنية العلاج ، قم بربط قنية وهمية بإحكام. ثم، تطبيق ميلوكسيكام تحت الجلد للسيطرة على الألم.
تسبب العلاج بالخلايا التائية CAR T الموجهة من GPC2 في حدوث انحدار كبير للورم في الورم الأرومي النخاعي والبقاء على قيد الحياة لفترة طويلة بشكل كبير في نموذج الورم الدبقي في خط الوسط المنتشر في المهاد. عند إدخال قنية التوجيه في مكان داخل الورم ، من المهم أن نفهم أن الإحداثيات الظهرية البطنية قد تكون أكثر سطحية من حقن الورم من أجل حساب أطوال إسقاط القنية الوهمية والعلاجية.
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول طريقة لزرع القنية اللقابية في الفئران، مما يسهل التقييم قبل السريري لعمليات التسريب المناعية المستهدفة لأورام الجهاز العصبي المركزي. تتيح التقنية جرعات متكررة من علاج الخلايا التائية المعدلة CAR دون الحاجة إلى عمليات جراحية غزويّة متعددة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- طب الأورام
- العلاج المناعي
الخلفية
- تعتبر أورام الجهاز العصبي المركزي السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان عند الأطفال.
- يتم اختبار العلاجات المناعية الموضعية في التجارب السريرية.
- يظهر علاج الخلايا التائية المعدلة CAR وعدًا في استهداف أورام الجهاز العصبي المركزي.
- يكرر هذا البروتوكول نظام القسطرة داخل البطين المستخدم في التجارب السريرية الجارية.
غرض الدراسة
- لتقييم فعالية علاج الخلايا التائية المعدلة CAR في نموذج ما قبل السريري.
- لتوفير طريقة للتسليم الموضعي الإقليمي للمعالجات.
- لتقليل التدخل المتكرر في العلاجات في نماذج الحيوانات.
الطرق المستخدمة
- زرع القنية باستخدام جهاز تعصيب معتمِد.
- إعطاء علاج الخلايا التائية المعدلة CAR من خلال القنية المزروعة.
- استخدام التخدير والتقنيات الجراحية لضمان رعاية الحيوان.
- مراقبة استجابة الورم ونتائج البقاء بعد العلاج.
النتائج الرئيسية
- أدت علاجات الخلايا التائية المعدلة CAR الموجهة لـ GPC2 إلى انحسار سرطاني كبير.
- تم ملاحظة بقاء مطول بشكل كبير في نموذج الورم الدبقي المنتشِر في المهاد.
- تتيح الطريقة التسليم الدقيق للعلاج إلى المناطق المستهدفة.
- قد تؤدي الرؤى المكتسبة إلى إغناء البحث المستقبلي في علم الأعصاب وطب الأورام.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول أداة قيّمة لدراسة أورام الجهاز العصبي المركزي.
- يعزز الفهم لفعالية علاج الخلايا التائية المعدلة CAR.
- قد يؤدي النهج إلى استراتيجيات علاجية محسّنة لأورام الجهاز العصبي المركزي.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Serial intracranial cannula implantation enables repeated locoregional CAR T cell delivery in preclinical CNS tumor models, directly addressing the challenge of evaluating immunotherapies in anatomically relevant, disease-relevant systems. This approach increases predictive confidence for translational advancement by mirroring clinical catheter-based delivery and supporting robust, quantitative assessment of therapeutic regimens. The platform is strategically positioned to inform target validation and dosing strategies for pediatric and adult CNS oncology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of CAR T cell efficacy against validated CNS tumor antigens in vivo.
- Supports mechanistic de-risking by isolating locoregional effects and minimizing systemic confounders.
- Facilitates iterative hypothesis testing for target engagement and tumor response.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible platform for serial dosing and response measurement.
- Enables quantitative assessment of tumor regression and survival following repeated CAR T cell infusions.
- Supports assay development for evaluating delivery site-specific therapeutic effects.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical delivery methods with clinical catheter-based protocols for translational continuity.
- Allows for risk-adjusted advancement decisions based on robust, serial in vivo data.
- Supports biomarker and pharmacodynamic studies in orthotopic CNS tumor models.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical validation by enabling serial, site-specific immunotherapy delivery in orthotopic CNS tumor models, supporting lead identification and translational assessment.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven testing of CAR T cell constructs and tumor antigen targets in vivo.
- Screening: Standardizes repeated dosing and quantitative tumor response measurement for candidate prioritization.
- Analytics: Provides survival and tumor regression data for comparative analysis across regimens and delivery sites.
- Translational Research: Mirrors clinical catheter-based delivery, supporting preclinical-to-clinical workflow alignment.
- Enterprise Reuse: Adaptable for testing diverse cell therapies and novel agents in CNS disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS immunotherapy studies.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible, and scalable serial dosing in preclinical models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency for CNS oncology programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunotherapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery and small animal CNS procedures.
- Demands access to stereotactic apparatus, surgical tools, and analytical infrastructure for tumor monitoring.
- Necessitates cross-team standardization of dosing, infusion protocols, and response criteria.
- Adaptable to various CNS tumor models and delivery coordinates with protocol optimization.
- Dependent on precise anatomical targeting and post-surgical animal care for reproducibility.
