قياس السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة في نموذج كروي للورم: تطبيق لاكتشاف الأدوية

يعتمد أحد أكثر علاجات السرطان المستهدفة فعالية على الأجسام المضادة مثل الأجسام المضادة ل HER2 تراستوزوماب. يتضمن العمل المضاد للسرطان لتراستوزوماب السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة ، ADCC ، بواسطة الخلايا القاتلة الطبيعية أو الخلايا القاتلة الطبيعية. قد يكون فهم الآليات التي تنظم حساسية الخلايا السرطانية للعلاج بالأجسام المضادة لمستقبلات عامل النمو مع إيلاء اهتمام خاص ل ADCC أمرا بالغ الأهمية لتطوير طرق علاج جديدة وأكثر كفاءة.

أثبتت نماذج 3D مثل كرويات الخلايا السرطانية تفوقها في التنبؤ بالاستجابات المناعية للأورام لمختلف العلاجات المضادة للسرطان. لذلك ، قمنا بإعداد نموذج كروي ADCC باستخدام خط الخلايا القاتلة الطبيعية NK92 ، وخلايا سرطان الثدي JIMT-1 التي تعبر عن GFP ، وتراستوزوماب. أنشأنا نظام فحص ADCC عن طريق حث خلايا سرطان الثدي JIMT-1 الإيجابية المضادة ل HER2 لتشكيل مجموعات ثلاثية الأبعاد تسمى كروية.

يعبر خط خلية JIMT-1 المستخدم في التجارب بثبات عن بروتين الفلورسنت الأخضر. نبدأ التجربة بإعداد الصفيحة المكونة من 96 بئرا لتشكيل الأجسام الكروية. من أجل إنشاء قاع على شكل حرف U وطارد للخلايا ، قم بتغطية اللوحة المكونة من 96 بئرا بمحلول من 0.5٪ من الأغاروز في برنامج تلفزيوني.

احتضن اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 إلى 45 دقيقة تقريبا. في غضون ذلك ، التربسين وعد خلايا JIMT-1 لبذر الخلايا. اغسل الخلايا بمليلتر من برنامج تلفزيوني معقم.

أضف ملليلتر من التربسين-EDTA إلى القارورة ، ثم أعد القارورة إلى حاضنة CO2 لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، انقر فوق القارورة للتحقق مما إذا كانت خلايا JIMT-1 قد انفصلت. أوقف عملية الهضم باستخدام ملليلتر من وسائط JIMT-1 ، واجمع تعليق الخلية في أنبوب سعة 50 ملليلتر.

عد الخلايا التي تحتوي على Trypan Blue في غرفة Burker ، واضبط رقم الخلية على 20،000 خلية لكل مل. قم بزرع الخلايا في لوحة 96 بئرا عن طريق سحب 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا لكل بئر لتشكيل كرويات. اسمح للخلايا بالتكتل معا خلال فترة الحضانة التي تستغرق ثلاثة أيام عند 37 درجة في حاضنة CO2.

تحقق من حجم وشكل الأجسام الكروية بانتظام باستخدام مجهر مقلوب. في اليوم الثالث بعد تحريض الأجسام الكروية ، قم بتغطية لوحة الغربلة عالية المحتوى المكونة من 96 بئرا بمحلول Pluronic F-127 في DMSO. الطلاء أمر بالغ الأهمية لمنع ارتباط كرويات JIMT-1 EGFP بالسطح الزجاجي أو اللوحة.

بعد فترة حضانة مدتها 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، قم بشفط محلول الطلاء ، واغسل الآبار مرتين باستخدام وسائط DMEM F12 الخالية من المصل. انقل الكرويات إلى لوحة الغربلة عالية المحتوى المكونة من 96 بئرا في ثلاث نسخ باستخدام ماصة سعة ملليلتر واحد. أضف سونيتينيب إلى الآبار بتركيز 40 ميكرومولار في 10 ميكرولتر لكل بئر ، ووسائط JIMT-1 الطازجة ماصة إلى آبار التحكم من أجل رفع الحجم.

احتضان اللوحة لمدة ساعة واحدة في حاضنة CO2 عند 37 درجة. أثناء استمرار حضانة الأجسام الكروية المعالجة مسبقا ، اجمع خلايا NK92 من القارورة في أنبوب سعة 15 ملليلتر. عد الخلايا التي تحتوي على Trypan Blue في حجرة Burker ، واضبط رقم الخلية للوصول إلى نسبة المستجيب إلى الهدف من 20 إلى 1.

تلطيخ الخلايا القاتلة الطبيعية بمحلول 10 ميكرومولار من CellTracker Blue ، ووضعها في حاضنة CO2 لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة. لغسل فائض الصبغة ، قم بطرد الخلايا القاتلة مرتين عند 150 RCF لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أعد تعليق الخلايا في وسائط JIMT-1 جديدة.

أضف الخلايا القاتلة الطبيعية الملطخة إلى الأجسام الكروية JIMT-1 EGFP المستهدفة عن طريق سحب 55 ميكرولتر لكل بئر جنبا إلى جنب مع تراستوزوماب الأجسام المضادة ل HER2. تمييع تراستوزوماب في وسط JIMT-1 للوصول إلى تركيز 10 ميكروغرام لكل مل. أضف 110 ميكرولتر من وسائط JIMT-1 الطازجة إلى آبار التحكم ، واحتضن اللوحة لمدة 24 ساعة في حاضنة CO2 عند 37 درجة.

نتيجة لذلك ، يبلغ الحجم الإجمالي للعلاج المضاف ل ADCC 110 ميكرولتر ، وتركيز سونيتينيب النهائي هو 20 ميكرومول لكل لتر. للكشف عن موت الخلايا المبرمج وقياسه بعد العلاجات ، قم بتلطيخ الكائنات الكروية باستخدام اقتران Annexin V Alexa Fluor 647 لمدة ساعة واحدة في وسائط JIMT-1. بعد الانتهاء من الخطوات التجريبية ، انقل اللوحة إلى جهاز تحليل المحتوى العالي.

يتم تصوير اللوحة بعد 24 ساعة من إضافة عوامل NK إلى الخلايا المستهدفة. للتصوير ، نستخدم محلل المحتوى العالي وبرنامج تحليل الصور. حدد نوع الصفيحة الدقيقة من قائمة اللوحات باستخدام خيار نوع اللوحة.

استخدم لوحة فحص عالية المحتوى ذات 96 بئرا. حدد اثنين من ذروة التركيز البؤري التلقائي حيث يتم إجراء المقايسات في لوحات ذات هدف 10x مع فتحة عدسة رقمية 0.3 ، باستخدام خيارات التركيز البؤري التلقائي والهدف على التوالي. اختر الوضع البؤري مع خيار OptiMode ، وقم بتطبيق Binning 2 لاستخدام خيار Binning.

لتصوير الأجسام الكروية ، حدد القنوات المناسبة باستخدام خيار تحديد القناة. للكشف عن خلايا JIMT-1 المنقولة ب EGFP ، اختر EGFP بوقت تكامل 200 مللي ثانية ، وطاقة ليزر 50٪ ، وارتفاع مكدس ميكرومتر ، وإثارة 488 نانومتر ، وأطوال موجية انبعاث 500 ، 550 نانومتر. وللكشف عن الخلايا المبرمج ، استخدم Alexa 647 مع وقت تكامل 100 مللي ثانية ، وطاقة ليزر 50٪ ، وارتفاع مكدس 10 ميكرومتر ، وإثارة 640 نانومتر ، وأطوال موجية انبعاث 650 ، 760 نانومتر.

لتصور الخلايا القاتلة الطبيعية داخل الكائنات الكروية ، اختر القناة التالية ، DAPI مع وقت تكامل 100 مللي ثانية ، وطاقة ليزر 50٪ ، وارتفاع مكدس ميكرومتر ، وإثارة 405 نانومتر ، وطول موجة انبعاث 435 ، 418 نانومتر. في خيار تحديد التخطيط، حدد مكدسات Z لأن الخلايا في الكرات تميل إلى أن تكون على مستويات بؤرية مختلفة من المجهر. 10 طائرات بمسافة 10 ميكرومتر كافية لتغطية المنطقة الكروية بأكملها.

اضبط قيم المستوى الأول والمستوى الأخير على 0 ميكرومتر و 90 ميكرومتر على التوالي. قبل بدء القياس ، يمكن التقاط عينات من الصور باستخدام وظيفة Snapshot للتحقق من الإعدادات الصحيحة. قم بتعيين عدد الآبار والحقول للتصوير باستخدام خيار التخطيط المحدد.

حدد الكرويات بواسطة مضان EGFP أو خلايا JIMT-1 باستخدام خيار منطقة النسيج الدقيق وقم بتصفيتها حسب الحجم. إزالة كائنات الحدود باستخدام الوحدة النمطية تحديد المحتوى. نظرا لأن الخلايا الموجبة للملحق تظهر على الأجسام الكروية المحيطية ، قم بقياس شدة Annexin في الحلقة المبرمجة.

في الوحدة النمطية تحديد المنطقة، اضبط الحد الخارجي على سالب 90. التعبير عن قيم شدة الملحق كمتوسط شدة. كما هو مبين في تلطيخ الملحق الخامس ، تسببت إضافة الخلايا القاتلة الطبيعية وتراستوزوماب إلى خلايا JIMT-1 في موت الخلايا في كرويات الورم.

ظهرت خلايا موت الخلايا المبرمج إيجابية الملحق في المنطقة الطرفية من كرويات. ومع ذلك ، في غياب تراستوزوماب ، لم تؤدي الخلايا القاتلة الطبيعية إلى موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية. للتمييز بين التأثيرات المباشرة أو بوساطة ADCC لتراستوزوماب ، تم استخدام تراستوزوماب-Fab2 الذي يفتقر إلى قدرة ربط منطقة FC في هذه الدراسة كعنصر تحكم سلبي.

نظرا لأن تراستوزوماب-Fab2 لم يكن فعالا في هذا النموذج ، فمن المحتمل أن يتم التوسط في موت الخلايا السرطانية عبر ADCC. علاوة على ذلك ، قللت المعالجة المسبقة باستخدام sunitinib من تلطيخ Annexin V في الكرات الكروية ، مما يؤكد مقاومة ADCC التي يسببها sunitinib ويكشف عن منع موت الخلايا المبرمج في كرويات JIMT-1 التي تم حضنها مع الخلايا القاتلة الطبيعية وتراستوزوماب. أكدت هذه البيانات التأثير الوقائي للخلايا لسونيتينيب في نموذج ADCC وتحث على توخي الحذر فيما يتعلق بالتوليفات المحتملة للعلاجات المناعية القائمة على ADCC و sunitinib.

باختصار ، قد يكون اختبار HCS الخاص بنا مناسبا لتحديد المركبات المعززة ل ADCC.