اختبار في نموذج ثقافة خلية 3D على أساس كروي للرأس والرقبة الحرشفية خلية العلاج

الهدف العام من هذه الطريقة في المختبر هو توليد كرويات زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد التي تمكن من اختبار أنظمة العلاج القياسية أو التجريبية الحالية لسرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة. تساعدنا هذه الطريقة على فهم نمو الورم ثلاثي الأبعاد لخلايا سرطان الرأس والرقبة عند تعرضها للإشعاع أو العلاج الكيميائي الإشعاعي. يبقى أن نقول أن التعامل مع الخلايا السرطانية الأولية أمر صعب ولا يؤدي دائما إلى تكوين كروي ثلاثي الأبعاد موثوق.

ستظهر الإجراء سابينا شوينك زيجر ، فنية من مختبرنا. أثناء استخدام الخلايا الأولية من عينة الورم ، ضع العينة على سطح مناسب ومعقم وقم وقم بقصها جيدا بمشرط معقم يستخدم مرة واحدة إلى قطع صغيرة جدا. بعد الفصل الميكانيكي الكافي للأنسجة الأولية ، قم بنقله إلى قارورة تحتوي على الكولاجيناز 1 و 2 واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، غربل الخليط من خلال مصفاة خلية فالكون 70 ميكرومتر واغسل المعلق باستخدام HBSS. بعد الفصل الناجح والغسيل اللاحق ، انقل المعلق الذي يحتوي على مليون إلى مليوني خلية إلى قارورة ثقافة خلية T75 لتنمو إلى التقاء فرعي عند 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى عشرة أيام. تحت المجهر ، تأكد من نمو الخلايا السرطانية.

عد الخلايا في الثقافة. باستخدام صفيحة منخفضة الالتصاق للغاية مكونة من 96 بئرا مع قيعان مستديرة مقعرة ، قم بزرع 5 ، 000 خلية سرطانية أولية ، أو 1 ، 000 إلى 2 ، 000 خلية من خط الخلايا الوسيط ، في 200 إلى 300 ميكرولتر من الوسائط في الآبار. بعد ذلك ، قم بزراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية.

قم بإجراء تغييرات على الوسائط كل يومين. انتبه إلى عدم شفط الكروي باستخدام الماصة أثناء تغييرات الوسائط. استزراع الكرويات حتى يتم ملاحظة تكتلات الخلايا ثلاثية الأبعاد على شكل كروي.

ضع في اعتبارك استبعاد الآبار ذات التكوين الكروي غير المنتظم أو المتعدد من مزيد من التحقيق. بعد ذلك ، قم بتغيير الوسائط إلى وسائط تحتوي على علاجات كيميائية و / أو أجسام مضادة وحيدة النسيلة بالتركيزات المرغوبة. أضف سيسبلاتين بتركيزات 2.5 أو خمسة أو 10 ميكرومولار أو 5-فلورويوراسيل عند 30 ميكرومولار.

في هذا الإجراء ، قم بقياس الحجم الكروي بعد توثيق الصور الرقمية في اليوم السادس واليوم 10 واليوم 16 باستخدام برنامج رسومي. بعد الطرد المركزي للوحة عند 520 جم لمدة 2.5 دقيقة ، قم بإزالة المادة الطافية. بعد ذلك ، اغسل الخلايا باستخدام 1x PBS وقم بالطرد المركزي للوحة مرة أخرى ، متبوعا بإزالة المادة الطافية.

بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من محلول انفصال الخلايا الأنزيمية إلى كل قارورة للسماح للكرويات بالذوبان. بعد ذلك ، احتضان اللوحة لمدة ثماني دقائق عند 37 درجة مئوية. تحقق من إذابة الكرويات بنجاح تحت المجهر.

أضف 100 ميكرولتر من DMEM. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للوحة على وزن 520 جم لمدة 2.5 دقيقة. ثم قم بإزالة المادة الطافية الخلايا في 100 ميكرولتر من DMEM.

بعد ذلك ، إذا لزم الأمر ، قم بإجراء اختبار الانتشار اللوني المتاح تجاريا وقراءة الاختبار في قارئ ELISA. يمكن لجميع خطوط الخلايا أن تولد كرويات موثوقة مع اختلافات في الحجم ووقت القراءة. شكلت الخلايا الأولية كرويات قابلة للتكاثر في ألواح تعلق منخفضة للغاية.

يكشف تلطيخ Ki-67 عن محيط الثقافة الذي يظهر معدلات تكاثر أعلى بكثير من الخلايا المركزية ، مما يحاكي توزيع المغذيات في الأورام المخاطية الصلبة التي غالبا ما تظهر نوى نخرية هنا ، تأثير العديد من العلاجات الكيميائية والإشعاع على حجم الكروية. يؤدي الإشعاع مع اثنين من الرمادي قبل العلاج بالسيسبلاتين ، إلى انخفاض كبير في الحجم الكروي مقارنة بالسيسبلاتين وحده.

مع مزيد من إنشاء توليد الكرويات من الخلايا البشرية الأولية ، هذه هي الطريقة التي يمكن بها تنفيذ مفهوم اختبار العلاج. سيتم إنشاء الكرات الكروية بعد خزعة الورم ، ثم يتم اختبارها للخصائص الجزيئية وقابلية العلاج. تمكنا من إنشاء بروتوكول لتوليد كرويات قابلة للتكاثر من معلقات الخلايا لكل من خطوط الخلايا والخلايا السرطانية البشرية الأولية.

هذا الاختبار متعدد الوسائط حساس بما فيه الكفاية لتحديد الاختلافات الصغيرة بين المجموعات. في المستقبل ، يمكن استخدام الاختبار أولا لتقييم الاستجابة الفردية لبروتوكولات العلاج القياسية والتجريبية. ثانيا ، قم بتوصيف الخلايا السرطانية من العينات الطازجة.

وثالثا ، ربط استجابة العلاج بالأنماط الجزيئية. سيسمح استخدام الخلايا الأولية وتوليد الفيريات بالحفاظ على أكبر عدد ممكن من خصائص نمو الورم في الجسم الحي جنبا إلى جنب مع اختبار فعال من حيث التكلفة لدراسة استجابة العلاج الفردية.