ميكروفلويديك طلبات للحصول على تشخيص احدة

اسمي كاثرين كلاود بريدج، وأنا أستاذة في التصنيع والهندسة والهندسة الطبية الحيوية في جامعة بوسطن. كما أشغل منصب مدير مختبر الأجهزة والمحيطات الدقيقة الطبية الحيوية. ونحن نعمل بشكل أساسي على تصنيع أدوات تشخيصية مخصصة للاستخدام لمرة واحدة للتطبيقات في المناطق ذات الموارد المحدودة.

لذلك، نستخدم الموائع الدقيقة (microfluidics) من أجل تصنيع هذه الأجهزة. نحن مهتمون في الواقع بمجالين من مجالات الدراسة؛ حيث ينصب اهتمامنا الأساسي على دراسة كيفية تفاعل الجزيئات الحيوية والخلايا مع أسطح البوليمرات البلاستيكية.

هذا هو المظلة الرئيسية لأعمالنا. ويتجسد هذا العمل في تطبيقات الموائع الدقيقة (microfluidics) للتشخيصات القابلة للاستخدام مرة واحدة. لذا، فإن ما نصنعه في المختبر هو أجهزة الموائع الدقيقة.

في المواد اللدنة بالحرارة، لا نستخدم عادةً مادة PDMS، وهي المادة المطاطية التي يستخدمها معظم الأشخاص لتصنيع أنظمة الموائع الدقيقة في المختبر. نحن نصنع أجهزتنا من المواد اللدنة بالحرارة. ونهتم باستخدام هذه الأجهزة اللدنة بالحرارة لإجراء البيولوجيا الجزيئية على المقياس الميكروي، بحيث يمكن تنفيذ تلك العمليات في الميدان بعيداً عن المختبرات المركزية.

وتتجلى آلية عمل ذلك في المختبر من خلال قيامنا بتصنيع بطاقات بلاستيكية صغيرة تحتوي بداخلها على أعمدة لاستخلاص الطور الصلب أو أعمدة لتحلل الخلايا أو أعمدة خلط. كما نقوم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل على الشريحة كتقنية للكشف. وتُدمج كل هذه العناصر في جهاز صغير يهدف البحث في منظوره طويل المدى إلى تحويله لجهاز متكامل يكون محمولاً باليد ويمكن نقله إلى الميدان أو إلى البيئات التي لا يتوفر فيها مختبر واسع النطاق بما يتضمنه من أجهزة طرد مركزي وحاضنات حرارية وغيرها.

لذا، فإننا نطمح مثاليًا إلى البدء بعينة بشرية، مثل الدم أو البول أو البراز، أو مسحة من البلعوم الأنفي على سبيل المثال، والتي تكون عبارة عن مخاط. ثم نحصل عند مخرج الشريحة على إجابة بنعم أو لا، حول ما إذا كان الشخص مصابًا بكائن حي دقيق معين. ونقوم بذلك من خلال البحث عن DNA أو RNA الخاص بذلك الكائن الحي الدقيق، اعتمادًا على نوعه، في عينة المريض.

لذا فإن التحديات التقنية التي تظهر تكمن إلى حد كبير في جانب تحضير العينة من هذه المعادلة. فعندما تبدأ بالدم أو البراز أو البول، يجب أن تنتقل من حالة تكون فيها لديك عينة بشرية غير نقية تحتوي على الكثير من الجسيمات المحتملة أو مثبطات لـ PCR أو تقنيات التضخيم الأخرى. وأنت تطمح في النهاية إلى الحصول على عينة شطف نظيفة جداً من الأحماض النووية التي يمكنك استخدامها بعد ذلك لتضخيم أو البحث عن DNA أو RNA محدد يخبرك ما إذا كان الكائن الدقيق الذي تبحث عنه موجوداً.

لذا، ومن أجل تنقية تلك العينات، يتعين عليك القيام ببعض الخطوات. أولاً، يجب ترشيح العينة، وهو أمر قد يتضمن ترشيحاً خشناً أو خطوة تدوير سريعة اعتماداً على نوع العينة، وذلك قبل وضع العينة على الشريحة. لذا، فإننا نحاول دائماً البدء بالعينات كما ترد من الطبيب السريري.

لذلك، بالنسبة للبول والبراز ومسحات البلعوم الأنفي، هدفنا هو أن يقوم 임 임klinician بعمله كالمعتاد وأخذ العينة بالطريقة التي يتبعها عادةً. ومن ثم نقوم بأخذ تلك العينة ووضعها على الرقائق. لذا، إذا كانت هناك حاجة لمزيد من الترشيح في تلك الخطوة، فإن عملية الترشيح ستحدث داخل الرقاقة.

تتضمن الخطوة الثانية، وبما أننا نجري مقاييس جزيئية، ضرورة تحليل الخلايا والكائنات الدقيقة الموجودة في تلك العينة. لذا، نقوم بعد ذلك بخطوة تحليل (lysis)، والتي تتضمن عادةً دفع العينة عبر مرشح ذي حجم مسام صغير. وأحياناً يحتوي هذا المرشح أيضاً على جسيمات نانوية مثل أنابيب الكربون النانوية، التي تمتلك حوافاً حادة يمكن استخدامها لتمزيق بعض الكائنات التي تمتلك جدران خلوية أكثر متانة مثل C difficile، وهي بكتيريا موجبة الجرام نتعامل معها ويصعب تحليلها للغاية.

لذا، يتعين علينا توفير أعمدة تحلل أكثر قوة. ولكن في العادة، نقوم بعملية تحلل كيميائية وميكانيكية مشتركة داخل الشريحة. بعد ذلك، يكون هدفنا هو أخذ ناتج التحلل ثم استخلاص الأحماض النووية المنقاة.

لذا، نقوم بتمرير ناتج التحلل عبر عمود استخلاص بالطور الصلب مدمج في الرقاقة الموائع دقيقة القنوات. ويتكون عمود الاستخلاص بالطور الصلب هذا من البلاستيك، ويتم تصنيعه باستخدام الكيمياء المستحثة ضوئياً داخل قناة الموائع دقيقة القنوات بعد الانتهاء من تصنيعها. وعادة ما يكون هذا العمود مشبعاً بجسيمات السيليكا لأننا نرغب في ربط الأحماض النووية وتحريرها.

في بعض الحالات، قمنا بدمج حبيبات oligo DT إذا كنا نرغب في ربط وتحرير mRNA على وجه التحديد، على سبيل المثال، أو حبيبات تحتوي على أجسام مضادة معينة، إذا أردنا ربط وتحرير بروتينات محددة. ويمكننا تصنيع أعمدة استخلاص تقوم بكل هذه المهام. ولكننا سنوضح لكم اليوم كيفية صنع عمود استخلاص sase باستخدام حبيبات السيليكا.

لذا، بعد قيامنا بذلك، يتم تمرير المستخلص الخلوي عبر عمود السيليكا، وهو يعمل تماماً كما تعمل مجموعة أدوات كيوجين (Qiagen) في المختبرات ذات النطاق الواسع. بعد ذلك، نقوم بعملية الغسل للتخلص من جميع المواد الأخرى غير المرغوب فيها، مثل جميع الكربوهيدرات والليبيدات والمواد الأخرى الموجودة في المستخلص الخلوي وفي بقية العينة البشرية التي لا نحتاجها. وفي النهاية، نقوم بعملية الاسترداد باستخدام الماء.

ومما يميز أعمدة الاستخلاص بالطور الصلب ذات المقياس الميكروي هو إمكانية الشطف باستخدام كمية صغيرة جداً من الماء، تتراوح عادةً بين 1 إلى 5 µL. وبذلك نستعيد جميع الأحماض النووية التي وضعناها تقريباً، حيث تبلغ نسبة الكفاءة حوالي 70 إلى 90% في أول 10 µL نستعيدها من تلك القناة.

لذلك، إذا قمنا بالغسيل مرتين باستخدام 2 إلى 10 µL، فإننا نستعيد تقريباً جميع الأحماض النووية التي وضعناها هناك. وبذلك، لا نحصل فقط على عينة نظيفة صالحة لتفاعل PCR، بل نحصل أيضاً على عينة ذات تركيز أعلى بكثير مما يمكن الحصول عليه باستخدام مجموعة أدوات المختبر القياسية. لذا فإن الهدف النهائي من جميع تقنيات تحضير العينات هذه هو إنتاج مواد متوافقة مع بعض الأعمال الأخرى التي قام بها الباحثون.

عمل رائع جداً في هذا المجال يوضح إمكانية إجراء تضخيم PCR على شريحة. كما يمكنك إجراء تفاعل النسخ العكسي على شريحة إذا كنت تتعامل مع فيروس RNA أو إذا كنت ترغب في إجراء تجربة تعبير جيني. يمكن ربط تقنيات تحضير العينات لدينا مباشرة بـ PCR على شريحة، وبذلك لن تضطر إلى القيام بأي من عمليات التنقية وتحضير العينات على طاولة المختبر.

وكذلك خطوة التركيز التي ستحتاج إلى القيام بها من أجل الحصول على الأحجام الضئيلة اللازمة لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المتعدد على شريحة صغيرة. لذا، فإن التجارب التي سنعرضها لكم اليوم توضح كيفية تجميع الشريحة الموائعية الدقيقة، والمصنوعة من اللدائن الحرارية وليس من مادة PDMS؛ لذا فهي تتطلب عملية تصنيع مختلفة قليلاً عن تلك المستخدمة عادةً، وتوضح كيفية ختم هذه الشرائح.

ومن ثم، نوضح كيفية إجراء الكيمياء التي يتم تحفيزها بالضوء داخل الشريحة لتصنيع المونوليثات البوليمرية المستخدمة في كل من تحلل الخلايا والاستخلاص بالطور الصلب. وفي نهاية هذه العملية، والتي تُعد حالياً عمليات نمطية في المختبر ولكن يمكن دمجها وقد دُمجت بالفعل، نحصل في النهاية على عينة عالية التركيز من الأحماض النووية، RNA وDNA في الماء، والتي يمكن توجيهها بعد ذلك إلى وحدة PCR أو وحدة تضخيم أخرى حيث يمكن تحديد الكائن الحي الدقيق أو العدوى. وفي الواقع، لدينا منحة نعمل عليها حالياً حيث بدأنا في جمع عينات بشرية من مركز بوسطن الطبي من مرضى قد يكونون مصابين أو غير مصابين بالإنفلونزا A. ونظراً لأننا في موسم الإنفلونزا، فإن هذه هي العينات التي نقوم بجمعها.

وبعد ذلك في المختبر، نقوم بإجراء المقايسات المرجعية (gold standard) للتحقق مما إذا كان الشخص مصاباً بالإنفلونزا A، وهو ما يتم أساساً عبر مقايسة الزرع التي تستغرق عدة أيام لتنفيذها. وبالتوازي مع ذلك، نقوم بتمرير هذه العينات عبر وحدات الرقاقة لدينا حالياً؛ حيث نمررها عبر عمود التحلل، ثم عبر عمود الاستخلاص بالطور الصلب، وبعد ذلك نجري تفاعل PCR لمعرفة مدى كفاءة أدائنا مقارنة بالطرق المرجعية.

هذا هو المستوى الذي وصلنا إليه حالياً. وإذاما تكللت هذه التجارب بالنجاح، أعتقد أنه خلال السنوات الأربع إلى الست القادمة ربما نصل إلى وضع يتوفر فيه رقاقة متكاملة ومقايسة كاملة لإنفلونزا A، كما أننا نعمل على Clostridium difficile وعينات البراز. ونحن أيضاً قريبون جداً ليس فقط من دمج الجهاز، بل وأيضاً دمج المقايسة.

لذا، يجب أن يتم تطوير المقايسة وتصميم الشريحة جنباً إلى جنب. وبالنسبة لتطبيق معين، للوصول إلى مرحلة الاستخدام السريري، فإنها في الواقع عملية موجهة نحو الهدف. يجب أن تكون على دراية بالعينة التي تبدأ بها والكائن الحي الدقيق الذي تبحث عنه من أجل تحسين الشريحة للاستخدام السريري.

لذا، لا أعتقد أننا بعيدون جداً عن تحقيق ذلك في شكل نموذج أولي. هذه هي أهدافنا النهائية، لذا آمل أن نصل إليها.