3D توليد أنسجة عضلة القلب البشرية باستخدام الكتابة الكهربائي الذائب لسقالات بولي كابرولاكتون وخلايا القلب المشتقة من hiPSC

يتم تقديم طريقة قابلة للتكرار لتوليد أنسجة عضلة القلب ثلاثية الأبعاد تجمع بين سقالات بولي كابرولاكتون (PCL) والكتابة الكهربائية الذائبة (MEW) وسقالات بولي كابرولاكتون (PCL) والهيدروجيل الفيبرين مع الخلايا العضلية القلبية والخلايا الليفية المشتقة من hiPSC. توفر هذه التقنية تحكما دقيقا في بنية السقالة ويمكن تطبيقها في اختبار الأدوية قبل السريرية ونمذجة أمراض القلب.

تهدف هذه الدراسة إلى تطوير أنسجة القلب ثلاثية الأبعاد البيومترية باستخدام السقالات الكهربائية الذائبة وخلايا القلب البشرية المشتقة من iPSC لتحسين نمذجة المرض واختبار الأدوية وتطبيقات الطب التجديدي. يظل التقرير الذي يسببه الإنسان في خلايا عضلة القلب بالخلايا الجذعية غير ناضج ، مما يحد من وظائفها. بالإضافة إلى ذلك ، من الصعب إعادة إنتاج التعقيد الشديد المطلوب لنمذجة أنسجة القلب في 3D.

يحاكي هذا النموذج عضلة القلب الأصلية بشكل أفضل ، مما يتيح تفاعلات مصفوفة ثلاثية الأبعاد معقدة خارج الخلية لنمذجة الأمراض واختبار الأدوية والتطبيقات الخاصة بالمريض. إنه يوفر بديلا أكثر صلة بالثقافات ثنائية الأبعاد والنماذج الحيوانية. من الآن فصاعدا ، سيركز بحثنا على التحقيق في نماذج طب الفطريات القلبية ، وتعزيز بروتوكولات نضوج الأنسجة ثلاثية الأبعاد ، وتطوير تركيبات أكبر لعلاجات احتشاء عضلة القلب قبل السريرية في نماذج الكبيرة مثل الخنازير.

للبدء ، قم بتوصيل المحقنة بأنبوب إمداد بالنيتروجين المضغوط وأدخله داخل غرفة التسخين. قم بتشغيل معدات الكتابة بالذوبان بالكهرباء واضبط منظمات درجة الحرارة على 80 درجة مئوية للغرفة و 65 درجة مئوية للفوهة. بعد 30 دقيقة، حرك لوحة التجميع حتى يتم وضع رأس الطباعة على إحدى حواف اللوحة أو أي مكان مرغوب.

اضبط المسافة بين غرفة التسخين ولوحة التجميع يدويا إلى 10 ملليمترات في المستوى z. أغلق باب الجهاز الذي يربط تلقائيا إمداد المجال الكهربائي. اضبط الجهد على سبعة كيلو فولت في ضغط النيتروجين على شريطين للبثق من خلال طرف المقياس 23.

قم بتحميل رمز G للتصميم في البرنامج لطباعة السقالات بهندسة نمط مربع. اضبط سرعة المجمع على 1080 ملم في الدقيقة. ثم اضغط على زر بدء الدورة لبدء الطباعة.

بعد الانتهاء من الطباعة ، قم بإزالة السقالة بعناية من المجمع. قم بقص الشبكة المطبوعة باستخدام ثقب قطره ستة ملليمترات للحصول على السقالات النهائية لتصنيع الأنسجة. عالج السقالات لمدة خمس دقائق ببلازما الأكسجين.

عقم الشبكات عن طريق غمرها في 70٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة. اغسلها على نطاق واسع بالماء المقطر المعقم لمدة 30 دقيقة ، ثم اتركها حتى تجف. بعد فصل الخلايا العضلية القلبية iPSC البشرية, إعادة تعليق بيليه الخلية في وسط توليد الأنسجة وحساب الخلايا باستخدام غرفة نيوباوير.

وبالمثل, بعد فصل الخلايا الليفية القلبية iPSC البشرية, إعادة تعليق بيليه الخلية في وسط توليد الأنسجة وعد الخلايا. امزج الخلايا الكلية المطلوبة في أنبوب جديد وقم بالإشارة إلى المحتويات باسم Cell Mix. وجهاز طرد مركزي عند 300 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ثم أعد تعليق مزيج الخلية في الحجم المطلوب من وسط توليد الأنسجة. لتوليد مزيج الهيدروجيل ، أضف الحجم المطلوب من الفيبرينوجين إلى الأنبوب في درجة حرارة الغرفة واخلطه بعناية. ضع مزيج الهيدروجيل على سطح بولي تترافلورو إيثيلين لمنع التصاق الفيبرين باللوحة.

الماصة نصف حجم الأنسجة ، وتركها كقطرة. ضع سقالة بولي كابرولاكتون ، أو PCL ، فوق كل قطرة وأضف الحجم المتبقي على السقالة. الآن ، أضف الكمية المطلوبة من الثرومبين واخلط الهيدروجيل بسرعة ، وتجنب الفقاعات بعناية.

احتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لإكمال بلمرة الفيبرين. التقط كل نسيج برفق من الحافة باستخدام ملاقط معقمة وانقلها إلى 12 لوحا جيدا تحتوي على وسط توليد الأنسجة المكمل بالبروتينين. احتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

في اليوم التالي ، قم بتحديث الوسط بملليلترين من وسط صيانة الأنسجة ، وإزالة بقايا KSR و Y-27. بذر ثمانية إلى اثنين من خليط من الخلايا العضلية القلبية iPSC البشرية والخلايا الليفية القلبية iPSC البشرية في هيدروجيل الفيبرين يؤدي إلى توزيع موحد للخلايا عبر مسام السقالة في غضون ساعة واحدة بعد البلمرة. أظهرت صور التألق المناعي متحد البؤر توزيعا مختلطا للخلايا من خلال الأنسجة ثلاثية الأبعاد تتفاعل مع سقالة PCL مع غالبية الخلايا العضلية القلبية iPSC البشرية الملطخة بالأكتينين الساركميري المتباعدة مع الخلايا الليفية القلبية iPSC البشرية المسمى vimentin.

تظهر الخلايا العضلية القلبية iPSC البشرية بنية قسط ساركومير جيدة التنظيم بواسطة بروتين الأكتينين السارمي المتباعدة بانتظام. بدأت الخلايا في الضرب التلقائي في اليوم الثاني بمتوسط تكرار ضرب يبلغ 30 نبضة في الدقيقة في اليوم السابع ، مما يدل على تقلص مستقر في جميع أنحاء الشبكة بأكملها. لوحظ انخفاض تدريجي بمرور الوقت ، حيث وصل إلى 17 نبضة في الدقيقة بحلول اليوم 14.

على الرغم من ذلك ، ظل نشاط التمثيل الغذائي مستقرا بين اليوم السابع واليوم الرابع عشر ، مما يؤكد صلاحية الخلية المستدامة. أخيرا ، أظهر تحليل نقطة المسار للأنسجة النابضة سرعة انكماش تبلغ 38 ميكرومتر في الثانية وسعة انكماش تبلغ 29 ميكرومتر.