التصوير الحي وتوصيف ديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة والتفاعلات مع المشابك في شبكية الفأر المريضة

نطاق أبحاث مختبرنا هو دراسة الآليات الأساسية للزرق والدبقية الصغيرة في إعادة تشكيل المشابك العصبية أثناء التطور. تدور التحديات التجريبية الحالية حول ما إذا كانت الخلايا الدبقية الصغيرة تفكك مشابك خلايا العقدة الشبكية بنشاط أم أنها تزيل الشوائب بشكل سلبي. ابدأ بوضع شبكية الفأر على ورق فلتر وجففها بمسح مختبر.

اقلب الشبكية على طبق MatTek Petri على القلب. ثقل الشبكية باستخدام خرزات معدنية أو خاتم. ثم أضف من ثلاث إلى خمس قطرات من السائل الدماغي الشوكي الصناعي.

ضع العينة تحت مجهر كونفوكال قرصي دوار واضبط الإعدادات لمعاينة الشبكية. اجمع الصور على طول محور Z بعمق إجمالي من 10 إلى 20 ميكرومتر باستخدام حجم خطوة 0.3 ميكرومتر. حافظ على الفاصل الزمني بين الإطارات عند 20 إلى 30 ثانية للسماح بتتبع موثوق للخلوات.

لأداء عرض السطح للميكروغليا، قم بتحويل ملف التايم لابس إلى صيغة IMS باستخدام برنامج محول الملفات. أدخل أحجام الفوكسل بناء على خصائص الصورة المكتسبة سابقا. في مجال برامج التحليل، انقر على مجلد الملاحظة لفتح الملف المحوله والتأكد من أن الصورة في عرض ثلاثي الأبعاد.

لاكتشاف ميكروغليا الفردية، انقر على أيقونة إضافة سطح جديد في شريط أدوات الكائنات. اختر مقطعا فقط منطقة اهتمام، تتبع الأسطح مع مرور الوقت، صنف الأسطح، وإحصائيات الكائن-الكائن تحت إعدادات الخوارزمية. ثم اضغط على زر التشغيل الأزرق للمتابعة.

اختر القناة الخاصة بعرض السطح. اختياريا، تفعيل الوضع السلس لتلطيف إنشاء السطح وإدخال تفاصيل السطح. تحت العتبة، اختر تقسيم التعلم الآلي لاكتشاف الخلايا.

تحت بيانات التدريب، استخدم أدوات فرشاة الرسم في الخلفية والأمام السابقة. ارسم ضربات فرشاة الرسم باختيار فرشاة الرسم المطلوبة واستخدام زر Shift Plus بزر الزر الأيسر. تأكد من تفعيل عرض الاستيفاء، ثم اختر القطار والتنبؤ.

استخدم المؤشر الأصفر في المنتصف للتنقل عبر محور Z. ارسم عدة خطوط عبر مستويات X وY وZ، وعبر عدة أطر زمنية. استخدم من ثلاث إلى خمس ضربات قصيرة لكل مدخل، مع تعديل تدريجي حتى يتم صنع سطح دقيق.

استخدم المستطيل الأصفر للتبديل بين شاشة التدريب والسطح الفعلي الذي تم إنشاؤه كفحص نهائي. أيضا، تحقق عبر الفاصل الزمني من أن السطح يطابق شكل الخلية. بعد الانتهاء، قم بإلغاء تحديد تقسيم الكائنات.

اضبط عتبة مخطط الفوكسل لإزالة الأجسام الصغيرة غير المتصلة التي ليست جزءا من السطح الأساسي. ثم قم بتعديل السطح يدويا لإزالة الأشياء الزائدة أو قطع الحواف باستخدام أداة المقص. إذا رغبت، حدد عتبة الفجوات المسموح بها للكائن واختر خوارزمية التتبع للخلية المتحركة.

فلتر تتبع الأجسام غير المرتبطة بالسطح الرئيسي. بعد الانتهاء، ضبط عرض الخلايا المتحركة على ملف شفاف لعرض البونكتا للخطوات التالية. لاكتشاف نقطة PSD95 الفردية، انقر على أيقونة السطح الأزرق في شريط أدوات الكائن.

ثم اختر أماكن المسار مع مرور الوقت، وصنف الأماكن، وإحصائيات الكائن-الكائن، ثم اضغط تشغيل. اختر القناة المصدرية لعلامة المشبك. قم بإيقاف برنامج التقطيع والقنوات الأخرى لعرض PSD95 فقط.

استخدم زر التحكم وأداة اختيار المؤشر لتقدير قطر XY للنقطة البنكتا. اختر بعض النقاط الساطعة التي تبقى عبر الإطارات وأوقف الطرح في الخلفية. بعد ذلك، أضف فلتر بناء على جودة البقعة.

قم بضبط المخطط البياني ليشمل نقاط PSD95 دقيقة عبر جميع الأطر الزمنية. قم بإزالة النقاط الإيجابية الكاذبة عبر التعديل. قم بالتبديل بين المؤشر المكعب أو الدائرة لحذف النقاط التي تدوم إطارا أو إطارا فقط.

إذا رغبت، حدد عتبة للفجوات المسموح بها واختر خوارزمية التتبع للبقع المشبكية. تصفية المسارات النقاطية غير المرتبطة بالبونكتا الحقيقية باستخدام عتبة الهيستوجرام لاستبعاد مسارات الأجسام الصغيرة. تعريف التصنيفات باستخدام أقصر مسافة إلى تصنيف السطح.

المجموعة مبتلئة كأي نقطة أقل من صفر ميكرومتر، وتلامس تقريبا بين صفر إلى 0.5 ميكرومتر من السطح، وغير متصلة بأكثر من 0.5 ميكرومتر. قم بتعيين تسميات للأحداث باستخدام التصنيفات التي ستجدها أعلاه. بمجرد أن تمثل الأسطح والبقع بشكل مناسب الخلايا الدبقية الصغيرة والنقطة، قم بتصدير جميع الإحصائيات تحت تبويب الإحصائيات.

أظهرت الخلايا الدبقية الصغيرة زيادة في طول إزاحة العملية بعد ارتفاع ضغط الدم العيني الناتج عن الليزر مقارنة بالضابطة. كانت سرعة الميكروغليالا أعلى بكثير في العيون المعالجة بالليزر مقارنة بالمجموعة الضابطة. زاد عدد حالات التلامس بين الخلايا الدبقية الصغيرة ونقطة PSD95 بعد العلاج بالليزر.

أظهرت تسجيلات الزمن أن الشبكية المعالجة بالليزر أظهرت حركة دقيقة دبقية أكبر وزيادة في التفاعل مع شبكية PSD95 مقارنة بالشبكية الضابطة. أظهرت نتائجنا المهمة زيادة في عدد الخلايا الدبقية الدقيقة، وتعقيدها، وحركتها، وتزامن التمركز المشبكي بعد ارتفاع الضغط داخل العين بشكل مؤقت في الفئران. يقدم بروتوكولنا التصوير خارج الجسم الحي، مما يساعد على تجنب مشاكل إعتام عدسة العين وعتامة القرنية، مما يتيح إعدادا أسهل لتجارب أسرع ومعدل إنتاج أعلى بشكل عام.

تدفع نتائجنا للبحث من خلال تمكين تصور تفاعلات الخلايا الدبقية الدقيقة والعصبونية، والتواصل الخلوي، والديناميكيات باستخدام خطوط الفلورسنت المعدلة وراثيا، بالإضافة إلى التصوير الزمني عالي الدقة.