تقنية فرز الخلايا السرطانية المنتشرة عالية الإنتاجية القائمة على الموائع الدقيقة وتقنية تسلسل الخلية الواحدة

نركز على تطوير طرق عزل وتحليل CTC عالية الأداء لتعزيز علم الأورام الدقيق من خلال خزعة السائل. تتميز منصات عزل CTC التجارية الحالية بمعدل نقل وكفاءة منخفضة. كما أنها غير متوافقة مع منصات التحليل اللاحق، مما يحد من استعادة المعلومات البيولوجية.

تستخدم هذه الدراسة منصة عزل CTC ميكروفلويدية لتحسين معدلات الكشف بشكل كبير. نستخدم أيضا شريحة تسلسل خلية واحدة نادرة لتحليل خزعة سائلة أعمق. للبدء، قم بإخراج 25 ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية المعدلة من الستربتافيدين المغسولة والمعاد تعليقها إلى أنبوب يحتوي على ميكروغرام واحد من الجسم المضاد البيوتينيل EpCAM.

حضن الخليط في درجة حرارة الغرفة مع التدوير بسرعة 20 دورة في الدقيقة لمدة 40 دقيقة لتحضير الخرزات المغناطيسية المناعية. باستخدام رف مغناطيسي، افصل الخرزات عن السوبرناتانت. بعد إزالة السوبرناتانت، أعد تعليق الخرزات في 25 ميكرولتر من مخزن العزل.

يتم استخدام 20 ميكرولتر من نظام التعليق المغناطيسي خلال ثانية إلى ثانيتين، لضمان عدم إدخال فقاعات هواء. ضع الشريحة عموديا على مغناطيس فورا ودع الخرزات تستقر لمدة خمس دقائق دون إزعاج. اجمع أربعة ملليلتر من عينة الدم في حقنة، مع التأكد من إزالة فقاعات الهواء.

أغلق مدخل ومخرج الشريحة بالسائل لإزالة فقاعات الهواء، ثم أدخل أنابيب المدخل والمخرج في الشريحة. باستخدام مضخة الحقنة، يتم حقن العينة بمعدل تدفق 1.5 ملليلتر في الساعة. بعد تحميل العينة، قم بحقن 60 ميكرولتر من DPBS في شريحة HB بمعدل تدفق 0.2 ملليلتر في الساعة لغسل الخلايا غير المربوطة.

قم بإزالة المغناطيس وحقن يدويا 1.5 ملليلتر من 5٪ BSA لغسل الشريحة وإطلاق الخلايا الورمية المحتجزة. حضر محلول 10٪ MPTS في الإيثانول. أدخل فورا 20 ميكرولتر من المحلول في شريحة HB واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة.

اشطف شريحة HB مرة واحدة بالإيثانول اللامائي، ثم جففها على حرارة 100 درجة مئوية لمدة ساعة. بعد ذلك، جهز محلول GMBS في الإيثانول بتركيز 0.5 ملليغرام لكل مليليتر. بعد تبريد الشريحة إلى 37 درجة مئوية، قدم محلول GMBS واحتضن.

اشطف شريحة HB مرتين بماء مقطر مزدوج، ثم شطفهما ب DPBS. أضف فورا 15 ميكروغرام لكل ملليلتر من الستربتافيدين إلى شريحة HB وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة أو طوال الليل عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة، اشطف شريحة HB مرتين بمحلول ملحي DPBS.

الآن جهز مخزن الأجسام المضادة CD45 بإضافة 0.2٪ BSA و20 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأجسام المضادة CD45 البيوتينيليلة إلى DPBS وضبط الحجم النهائي. حقن 20 ميكرولتر من مخزن الأجسام المضادة CD45 في شريحة HB لاختيار سلبي لخلايا الدم البيضاء. بعد حضانة لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة، اشطف الشريحة ب DPBS.

أضف محلول حجب يحتوي على 3٪ BSA و0.05٪ Tween 20 إلى شريحة HB. استنشق العينة المحضرة إلى حقنة، مع التأكد من عدم وجود فقاعات هواء. ثم أغلق مدخل ومخرج الشريحة بالسائل وقم بتوصيل أنابيب المدخل والمخرج بالشريحة.

باستخدام مضخة حقنة، يتم حقن العينة بمعدل تدفق 0.6 ملليلتر في الساعة. اجمع خلايا الورم المنقاة من مخرج الشريحة للعد وتسلسل الخلايا الفردية. بيبيت 200 ميكرولتر من محلول 0.5٪ F-68 محضر بنظام DPBS إلى مدخل الشريحة.

قم بتنفيذ صوت حمام الماء أثناء حمل الشريحة. عندما تكون الفقاعات مرئية عبر المنطقة الميكرومسامية، استمر في السونيك لمدة 30 ثانية لإزالة الفقاعات من الآبار المزدوجة. بعد ذلك، حقن 200 ميكرولتر من تعليق خلايا الورم في الشريحة التي تحتوي على 60,000 بئر مزدوج.

قم بعمل بمطارة لتعليق الخلية في الشريحة للأعلى والأسفل مرتين. ثم ضعها على جهاز إزالة اللون مرة أخرى لمدة خمس دقائق لإعادة تعليق الخلايا غير الملقطة والسماح لها بالاستقرار مجددا. الآن أضف 200 ميكرولتر من DPBS ومحلول F-68 بنسبة 0.5٪ عبر المدخل والسحب من المخرج.

بعد إعادة تعليق نظام التعليق الباركود، قم فورا بحقن 200 ميكرولتر من نظام التعليق في مدخل الشريحة واهتز بسرعة 10 دورات في الدقيقة لمدة 20 ثانية. قم بتعليق خرز الماصة مرتين بلطف قبل إعادتها إلى الهزاز. الآن اسحب تعليق الحبيبات المشرف من المخرج، ثم استخدم 200 ميكرولتر من محلول Tris-EDTA بحجم 20X ومحلول ثنائي ثيوثرايتول بوزن 50 ملم مول.

سحب السائل من المخرج. لتحلل الخلية والتقاط MRNA، أضف تدريجيا 200 ميكرولتر من مخزن تحلل الخلية إلى مدخل الشريحة. أضف فورا 200 ميكرولتر من الزيت المعدني لإغلاق الآبار المزدوجة.

قم بإزالة المحلول الذي يتدفق من مخرج الرقائق إلى خزان النفايات. ثم ضع الشريحة أفقيا واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. أضف ببطء 200 ميكرولتر من محلول سترات الصوديوم المالح 6X إلى المدخل.

أزل السائل المهدر واسحب المحلول المتبقي من مخرج الشريحة. أضف ببطء 200 ميكرولتر من سترات الصوديوم المالح 6x لملء الشريحة. أمسك مغناطيسا بالقرب من سطح الشريحة وحركها ببطء من المدخل إلى المخرج لجمع خرز باركود.

استنشق المحلول والحبيبات بسرعة داخل أنبوب طرد مركزي يحتوي على سترات الصوديوم المالحة 6X. اغسل الخرزات المشفرة ثلاث مرات ب 200 ميكرولتر من سترات الصوديوم المالحة 6X، تليها مرة واحدة باستخدام محلول النسخ العكسي. لوحظ توزيع منتظم للخرزات المناعية المغناطيسية تحت المجال المغناطيسي، بينما أكدت الخرزات المتبقية القليلة بعد الإزالة المغناطيسية نجاحا في الإطلاق.

قامت شريحة عزل CTC بالتقاط خلايا الورم بكفاءة من عينات بحجم 1 ملليلتر و10 ملليتر. إضافة شريحة التنقية زادت من نقاء خلايا الورم. في عينات الدم الطرفية التي تحتوي على عدد قليل من الخلايا LNCaP، حافظ نظام فرز CTC على كفاءة التقاط عالية ونقاء عاليين.

حققت شريحة الترميز الشريطي أحادية الخلية نسبة احتلال للخرزات المشفرة 85.6٪ و95.7٪، مما أدى إلى معدل اقتران 81.9٪. زيادة عدد الخلايا المحملة حسنت نسبة الإشغال الدقيق دون تقليل كفاءة الالتقاط. أدى العزل المتكامل لتقنية CTC وتسلسل الخلايا الفردية إلى إنتاج خلايا أورامية نقية للغاية واحتفظ بدقة بنسب الخلايا الورمية الأصلية. فصل تحليل TSNE خلايا PC3 وLNCaP وجوركات بشكل واضح إلى ثلاث عناقود، كل منها يتميز بتعبير فريد من علامات العلامة.

تم تحديد تجمع خلايا جوركات من خلال التعبير القوي عن TRBC1، IGLL1، CD1E، وCD3D، وتم تأكيده من خلال إثراء المسار لتنشيط الخلايا التائية. تم تمييز عناقيد PC3 وLNCaP بجينات معبر عنها بشكل تفاضلي، حيث أظهر PC3 تعبيرا عاليا عن البروتينات الدقيقة وLNCaP الذي يعبر عن NEDD4.