رقاقة الموائع الدقيقة لبناء نماذج الإصابات المحورية وتمكين تحليل الأوميكس المتعدد

لقد قمنا بتطوير رقائق الموائع الدقيقة على نطاق واسع لتمكين تحليل multiomics ، بهدف توضيح آلية التمثيل الغذائي للخلايا العصبية بعد الإصابة المحورية. نحن نستخدم بشكل أساسي تقنية الموائع الدقيقة ، وتحليل التدفق الأيضي ، وعلم النسخ لتعزيز البحث حول آليات التمثيل الغذائي للخلايا العصبية أثناء الإصابة المحورية وتجديدها. وجدنا أن هناك اختلافات في التمثيل الغذائي بين الخلايا العصبية القشرية في أمراض تنموية مختلفة ، وأن الخلايا العصبية الصغيرة تخضع لإعادة تشكيل التمثيل الغذائي بعد الإصابة الخارجية.

تكمن الميزة الأساسية لبروتوكولنا في تصميم المنصة الدقيقة على نطاق واسع والمعايير التشغيلية ، والتي تتيح تعدد الأوميكال الدقيقة وحجم ملايين الخلايا. للبدء ، انقل قاعدة PDMS وعامل المعالجة إلى أنبوب الطرد المركزي. ضع أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على الخليط في خلاط التقليب بالطرد المركزي.

جهاز طرد مركزي عند 2 ، 000 جم لمدة أربع دقائق مرتين للخلط والتفريغ. صب 13 إلى 15 جراما من PDMS منزوع الغاز في قالب الموائع الدقيقة ، مما يضمن تغطية الجزء السفلي من القالب بالكامل. الآن ، ضع القالب في مجفف مفرغ ، ثم استخدم مضخة تفريغ لتفريغ الهواء لمدة خمس إلى 10 دقائق لإزالة الفقاعات تماما من PDMS.

باستخدام لمبة مطاطية ، اضغط برفق على سطح PDMS لكسر أي فقاعات سطحية متبقية. انقلي القالب إلى فرن حراري واخبزيه على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 100 دقيقة لعلاج بولي ديميثيل سيلوكسان. بمجرد معالجة PDMS تماما ، حرك طرف المشرط برفق أسفل حافة PDMS لرفعه بعناية وفصله عن القالب.

باستخدام ثقب خزعة بقطر 2.0 إلى 2.5 ملم ، قم بإنشاء ثقوب في PDMS لتسريب وسط المزرعة وتحميل الخلايا. قم بإزالة أي شوائب سطحية من PDMS باستخدام شريط لاصق ، ثم ضعه في طبق زجاجي نظيف ولفه بورق الألمنيوم للتخزين. قبل التجربة ، قم بتعقيم جهاز الموائع الدقيقة عند 121 درجة مئوية و 101 كيلو باسكال لمدة خمس دقائق لضمان العقم.

ضع قذرة غطاء مخصصة للأجهزة التقليدية في طبق مزرعة 35 ملم. أضف ملليلترين من 0.1 ملليغرام لكل مليلتر من محلول بولي دي ليسين إلى الطبق. احتضن الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ست ساعات أو طوال الليل.

بعد الحضانة ، استرجع بعناية محلول poly-D-lysine لإعادة استخدامه أو التخلص منه بشكل صحيح. الآن ، أضف ملليلترين من الماء المعقم عالي النقاء إلى الطبق. قم بتدويرها 50 مرة في اتجاه عقارب الساعة ، متبوعة ب 50 مرة عكس اتجاه عقارب الساعة.

استنشاق الماء باستخدام مضخة تفريغ متصلة بطرف ماصة معقمة ، وجمع النفايات في حاوية نفايات سائلة. بعد اكتمال جميع عمليات الغسيل ، اترك الغطاء ينزلق ليجف في الهواء بشكل طبيعي في خزانة السلامة الحيوية قبل الاستخدام. باستخدام ملقط معقم ذو طرف رفيع ، ضع رقاقة الموائع الدقيقة المعقمة في وسط السطح الزجاجي مع توجيه القنوات الدقيقة لأسفل.

اضغط برفق على الشريحة على السطح الزجاجي باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لضمان الالتصاق الكامل. بعد ذلك ، ضع علامة على الغرفة اليسرى بنقطة باستخدام علامة دائمة لتعيين حجرة سوما. استنشق 10 ميكرولتر من التعليق العصبي باستخدام ماصة 10 ميكرولتر ، ثم قم بتوزيع التعليق ببطء في منفذ التحميل فوق حجرة سوما المحددة.

تأكد من تدفق السوائل المناسب إلى الخزان السفلي للغرفة اليسرى. انقل طبق الاستزراع إلى حاضنة مرطبة على 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، ضع الطبق تحت مجهر 20X لتأكيد وفرة الوسائط من حجرة سوما إلى الحجرة المحورية من خلال القنوات الدقيقة.

الآن ، ماصة 150 ميكرولتر من الوسط القاعدي العصبي إلى المنفذ العلوي للحجرة المحورية. وبالمثل ، أضف 150 ميكرولتر من الوسط العصبي الكامل إلى المنفذ العلوي لحجرة سوما. بعد ذلك ، صب 20 مل من الماء فائق النقاء في طبق ثقافة 150 ملم لإنشاء غرفة رطوبة.

ضع طبق الاستزراع مقاس 35 ملم داخل الطبق الكبير ، ثم انقل نظام الاستزراع بالكامل إلى الحاضنة وحافظ عليه طوال المدة المطلوبة. استخدم طبق بتري بعرض 10 سم لوضع جهاز الموائع الدقيقة واسع النطاق. اختر إما بذر قناة كاملة أو قناة فاصلة بناء على الاحتياجات التجريبية ، حيث تتطلب كل طريقة بروتوكولات إصابة محورية مختلفة.

بعد اكتمال البذر ، أضف خمسة ملليلتر من وسط زراعة الخلايا العصبية الكامل إلى طبق بتري للحفاظ على نمو الخلايا العصبية. انقل كمية مناسبة من الوسط القاعدي العصبي إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مليلترا لاستخدامه لاحقا. ضع جهازا موائعا دقيقة يحتوي على الخلايا العصبية القشرية على مقعد نظيف.

باستخدام ورق خال من النسالة، جفف الجزء السفلي من طبق الاستزراع مقاس 35 ملم، ثم استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر لشفط الوسيط من الفتحتين الجانبيتين الأيمن لجهاز الموائع الدقيقة. بعد ذلك، قم بتوصيل أنبوب مضخة التفريغ بطرف ماصة معقم وخالي من المرشح سعة 200 ميكرولتر. قم بتشغيل مضخة التفريغ بمعدل شفط 60 لترا في الدقيقة ووجه الطرف عند نقطة الاتصال بين الفتحة السفلية للغرفة الطرفية المحورية والغرفة لشفط الوسط القديم ، مما يتسبب في كسر المحور العصبي بسبب الضغط السلبي.

استبدل طرف الماصة وارسم 150 ميكرولتر من الوسط القاعدي العصبي ، وأضفه ببطء من خلال الفتحة السفلية للغرفة اليمنى. بعد إجراء الإضافة والشفط أربع مرات ، استبدل بوسط عصبي كامل جديد ، ثم استنشق الوسط القديم من الفتحة الجانبية لجسم الخلية وأضف وسط عصبي كامل جديد يحتوي على أدوية إذا لزم الأمر. ضع جهاز الموائع الدقيقة مع طبق الاستزراع في طبق مزرعة 150 ملم واستمر في الزراعة للوقت المطلوب ، مثل 24 ساعة.

بالنسبة للإصابة المحورية اليدوية ، قم بإدخال الخلايا العصبية للبذور في جميع غرف جهاز الموائع الدقيقة واسع النطاق. احتضان الجهاز على حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام. في اليوم السابع في المختبر ، قم بإزالة طبق الاستزراع الذي يحتوي على جهاز الموائع الدقيقة من الحاضنة وضعه على مرحلة معقمة.

قم بإعداد مجهر بتكبير 20X وتعقيم منطقة العمل باستخدام 75٪ إيثانول. أمسك طرف ماصة مفلتر معقم سعة 10 ميكرولتر وحدد حزم المحاور العصبية في القنوات الدقيقة الأصلية تحت توجيه المجهر. قم بإجراء خدوش طولية على طول كل حزمة محورية باستخدام طرف الماصة.

راقب كسر المحور العصبي تحت المجهر في الوقت الفعلي. تسمح القنوات الدقيقة لجهاز الموائع الدقيقة القياسي بنمو المحاور ، ولكن ليس سوما ، كما أكد تلطيخ بيتا ثلاثة توبولين في سبعة أيام في المختبر. لم تظهر كثافة الخلايا العصبية فرقا معنوي بعد الإصابة المحورية ، مما يشير إلى عدم وجود موت عصبي ملحوظ.

تم تطوير جهاز موائع دقيقة واسع النطاق بتصميم ثلاثي الأبعاد قابل للتوسيع لتحليلات الميكروميكس. تلتصق كل من النسخ المتماثلة PDMS غير المثقوبة والمثقبة بإحكام بأطباق 10 سم أو لوحات الكمبيوتر. أدى الضرر المحوري الناجم عن خدش طرف الماصة إلى محاور مقطوعة بوضوح مع تعطيل التشكل ، على عكس المحاور السليمة قبل الإصابة.

لوحظ تجديد المحوري في كل من ست ساعات و 24 ساعة بعد الإصابة ، بينما ظلت المحاور غير المصابة مستقرة. ارتفع تركيز البروتين العصبي بشكل ملحوظ من 1420.4 ميكروغرام لكل مليلتر في خط الأساس إلى 1748.9 لكل مليلتر في ست ساعات ، و 1823.7 ميكروغرام لكل مليلتر بعد 24 ساعة من الإصابة. كانت عوائد الحمض النووي الريبي من مجموعات التحكم والمحاور المتطابقة تقريبا.

كشف تسلسل الحمض النووي الريبي عن 595 جينا خاصا بالإصابة و 609 جينا خاصا بالتحكم ، مع 17،471 جينا مشتركا بين المجموعات. حدد تحليل مسار KEGG تنظيما كبيرا للفسفرة المؤكسدة ، واستجابة أنواع الأكسجين التفاعلية ، والالتهام الذاتي ، ومسارات دورة TCA بعد الإصابة.