Microfluidic Chip for Axonal Injury Models Construction and Enabling Multi-Omics Analysis

Bing Zhou; Ruixuan Liu; Jiaxin Sun; Maoliang Lu; Qianwen Zhang

doi:10.3791/68915

رقاقة الموائع الدقيقة لبناء نماذج الإصابات المحورية وتمكين تحليل الأوميكس المتعدد

JoVE Journal
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Neuroscience

Microfluidic Chip for Axonal Injury Models Construction and Enabling Multi-Omics Analysis

رقاقة الموائع الدقيقة لبناء نماذج الإصابات المحورية وتمكين تحليل الأوميكس المتعدد

Full Text

1,164 Views

11:00 min

October 14, 2025

DOI: 10.3791/68915-v

Bing Zhou^1,2, Ruixuan Liu^1,3, Jiaxin Sun^1,3, Maoliang Lu⁴, Qianwen Zhang⁵

¹Beijing Advanced Innovation Center for Big Data-Based Precision Medicine,Beihang University, ²Interdisciplinary Innovation Institute of Medicine and Engineering,Beihang University, ³School of Biological Science and Medical Engineering,Beihang University, ⁴School of Software,Beihang University, ⁵School of Beijing,Beihang University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents a microfluidic system designed to investigate neuronal metabolic dynamics following axonal injury. The platform allows for imaging and multi-omics analysis to understand the intrinsic metabolic remodeling of neurons during this process.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Neurobiology
Metabolic Dynamics

Background

Neurons respond to axonal injury through various metabolic adjustments.
Cortical neurons display differing metabolic profiles at various developmental stages.
Understanding these mechanisms can contribute to insights into neuronal regeneration.
Previous research has indicated the necessity for innovative platforms to study such processes.

Purpose of Study

To elucidate the metabolic mechanisms at play in neurons after axonal injury.
To utilize a large-scale microfluidic platform for comprehensive analysis.
To provide new insights into metabolic remodeling in young neurons post-injury.

Methods Used

The primary platform is a large-scale microfluidic chip, facilitating manipulation and observation of neuronal cells.
Cortical neurons serve as the biological model, focusing on their responses to induced axonal damage.
Multiomics workflows, including transcriptomics and metabolic flux analysis, are employed to gather comprehensive data.
Critical steps include preparing and autoclaving the microfluidic device, as well as the precise handling of neuronal culture.
Operational protocols are clearly outlined to ensure replicability and accuracy in the approach.

Main Results

Findings reveal metabolic differences among cortical neurons correlated to their developmental stage.
Young neurons demonstrate significant metabolic remodeling post-axonal injury.
Data indicate key mechanistic insights into neuronal injury responses and regenerative capabilities.
Conclusive outcomes reinforce the potential of multi-omic approaches in neurobiological research.

Conclusions

This study provides a novel methodology for exploring neuronal metabolic processes after injury.
Insights gained through multiomics analysis enhance the understanding of neuronal plasticity and recovery.
Implications extend towards developing therapeutic strategies for neuronal damage and regeneration.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of the microfluidic platform?

The microfluidic platform enables precise control over the neuronal environment and allows for high-throughput analysis of metabolic dynamics in a controlled setting.

How is the axonal injury implemented in the study?

Axonal injury is introduced through a series of controlled aspiration and replacement of culture medium, mimicking injury conditions.

What types of data are obtained from the microfluidic system?

The system provides insights into metabolic flux, gene expression changes, and cellular responses, crucial for understanding neuron behavior post-injury.

How can this method be adapted for other neuronal studies?

Researchers can modify culture conditions, expand types of neuronal cells used, or integrate additional analyses such as proteomics based on experimental needs.

What limitations should be considered when using this method?

Considerations include the potential variability in neuronal responses and the need for careful handling to minimize contamination and ensure data accuracy.

يصف هذا البروتوكول نظاما موائعا دقيقة ينمذجة ديناميكيات التمثيل الغذائي العصبية بعد الإصابة المحورية ، مما يتيح التصوير ، وتحليل الأوميكس المتعدد ، والدراسات الميكانيكية لإعادة تشكيل التمثيل الغذائي الجوهري.

لقد قمنا بتطوير رقائق الموائع الدقيقة على نطاق واسع لتمكين تحليل multiomics ، بهدف توضيح آلية التمثيل الغذائي للخلايا العصبية بعد الإصابة المحورية. نحن نستخدم بشكل أساسي تقنية الموائع الدقيقة ، وتحليل التدفق الأيضي ، وعلم النسخ لتعزيز البحث حول آليات التمثيل الغذائي للخلايا العصبية أثناء الإصابة المحورية وتجديدها. وجدنا أن هناك اختلافات في التمثيل الغذائي بين الخلايا العصبية القشرية في أمراض تنموية مختلفة ، وأن الخلايا العصبية الصغيرة تخضع لإعادة تشكيل التمثيل الغذائي بعد الإصابة الخارجية.

تكمن الميزة الأساسية لبروتوكولنا في تصميم المنصة الدقيقة على نطاق واسع والمعايير التشغيلية ، والتي تتيح تعدد الأوميكال الدقيقة وحجم ملايين الخلايا. للبدء ، انقل قاعدة PDMS وعامل المعالجة إلى أنبوب الطرد المركزي. ضع أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على الخليط في خلاط التقليب بالطرد المركزي.

جهاز طرد مركزي عند 2 ، 000 جم لمدة أربع دقائق مرتين للخلط والتفريغ. صب 13 إلى 15 جراما من PDMS منزوع الغاز في قالب الموائع الدقيقة ، مما يضمن تغطية الجزء السفلي من القالب بالكامل. الآن ، ضع القالب في مجفف مفرغ ، ثم استخدم مضخة تفريغ لتفريغ الهواء لمدة خمس إلى 10 دقائق لإزالة الفقاعات تماما من PDMS.

باستخدام لمبة مطاطية ، اضغط برفق على سطح PDMS لكسر أي فقاعات سطحية متبقية. انقلي القالب إلى فرن حراري واخبزيه على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 100 دقيقة لعلاج بولي ديميثيل سيلوكسان. بمجرد معالجة PDMS تماما ، حرك طرف المشرط برفق أسفل حافة PDMS لرفعه بعناية وفصله عن القالب.

باستخدام ثقب خزعة بقطر 2.0 إلى 2.5 ملم ، قم بإنشاء ثقوب في PDMS لتسريب وسط المزرعة وتحميل الخلايا. قم بإزالة أي شوائب سطحية من PDMS باستخدام شريط لاصق ، ثم ضعه في طبق زجاجي نظيف ولفه بورق الألمنيوم للتخزين. قبل التجربة ، قم بتعقيم جهاز الموائع الدقيقة عند 121 درجة مئوية و 101 كيلو باسكال لمدة خمس دقائق لضمان العقم.

ضع قذرة غطاء مخصصة للأجهزة التقليدية في طبق مزرعة 35 ملم. أضف ملليلترين من 0.1 ملليغرام لكل مليلتر من محلول بولي دي ليسين إلى الطبق. احتضن الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ست ساعات أو طوال الليل.

بعد الحضانة ، استرجع بعناية محلول poly-D-lysine لإعادة استخدامه أو التخلص منه بشكل صحيح. الآن ، أضف ملليلترين من الماء المعقم عالي النقاء إلى الطبق. قم بتدويرها 50 مرة في اتجاه عقارب الساعة ، متبوعة ب 50 مرة عكس اتجاه عقارب الساعة.

استنشاق الماء باستخدام مضخة تفريغ متصلة بطرف ماصة معقمة ، وجمع النفايات في حاوية نفايات سائلة. بعد اكتمال جميع عمليات الغسيل ، اترك الغطاء ينزلق ليجف في الهواء بشكل طبيعي في خزانة السلامة الحيوية قبل الاستخدام. باستخدام ملقط معقم ذو طرف رفيع ، ضع رقاقة الموائع الدقيقة المعقمة في وسط السطح الزجاجي مع توجيه القنوات الدقيقة لأسفل.

اضغط برفق على الشريحة على السطح الزجاجي باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لضمان الالتصاق الكامل. بعد ذلك ، ضع علامة على الغرفة اليسرى بنقطة باستخدام علامة دائمة لتعيين حجرة سوما. استنشق 10 ميكرولتر من التعليق العصبي باستخدام ماصة 10 ميكرولتر ، ثم قم بتوزيع التعليق ببطء في منفذ التحميل فوق حجرة سوما المحددة.

تأكد من تدفق السوائل المناسب إلى الخزان السفلي للغرفة اليسرى. انقل طبق الاستزراع إلى حاضنة مرطبة على 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، ضع الطبق تحت مجهر 20X لتأكيد وفرة الوسائط من حجرة سوما إلى الحجرة المحورية من خلال القنوات الدقيقة.

الآن ، ماصة 150 ميكرولتر من الوسط القاعدي العصبي إلى المنفذ العلوي للحجرة المحورية. وبالمثل ، أضف 150 ميكرولتر من الوسط العصبي الكامل إلى المنفذ العلوي لحجرة سوما. بعد ذلك ، صب 20 مل من الماء فائق النقاء في طبق ثقافة 150 ملم لإنشاء غرفة رطوبة.

ضع طبق الاستزراع مقاس 35 ملم داخل الطبق الكبير ، ثم انقل نظام الاستزراع بالكامل إلى الحاضنة وحافظ عليه طوال المدة المطلوبة. استخدم طبق بتري بعرض 10 سم لوضع جهاز الموائع الدقيقة واسع النطاق. اختر إما بذر قناة كاملة أو قناة فاصلة بناء على الاحتياجات التجريبية ، حيث تتطلب كل طريقة بروتوكولات إصابة محورية مختلفة.

بعد اكتمال البذر ، أضف خمسة ملليلتر من وسط زراعة الخلايا العصبية الكامل إلى طبق بتري للحفاظ على نمو الخلايا العصبية. انقل كمية مناسبة من الوسط القاعدي العصبي إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مليلترا لاستخدامه لاحقا. ضع جهازا موائعا دقيقة يحتوي على الخلايا العصبية القشرية على مقعد نظيف.

باستخدام ورق خال من النسالة، جفف الجزء السفلي من طبق الاستزراع مقاس 35 ملم، ثم استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر لشفط الوسيط من الفتحتين الجانبيتين الأيمن لجهاز الموائع الدقيقة. بعد ذلك، قم بتوصيل أنبوب مضخة التفريغ بطرف ماصة معقم وخالي من المرشح سعة 200 ميكرولتر. قم بتشغيل مضخة التفريغ بمعدل شفط 60 لترا في الدقيقة ووجه الطرف عند نقطة الاتصال بين الفتحة السفلية للغرفة الطرفية المحورية والغرفة لشفط الوسط القديم ، مما يتسبب في كسر المحور العصبي بسبب الضغط السلبي.

استبدل طرف الماصة وارسم 150 ميكرولتر من الوسط القاعدي العصبي ، وأضفه ببطء من خلال الفتحة السفلية للغرفة اليمنى. بعد إجراء الإضافة والشفط أربع مرات ، استبدل بوسط عصبي كامل جديد ، ثم استنشق الوسط القديم من الفتحة الجانبية لجسم الخلية وأضف وسط عصبي كامل جديد يحتوي على أدوية إذا لزم الأمر. ضع جهاز الموائع الدقيقة مع طبق الاستزراع في طبق مزرعة 150 ملم واستمر في الزراعة للوقت المطلوب ، مثل 24 ساعة.

بالنسبة للإصابة المحورية اليدوية ، قم بإدخال الخلايا العصبية للبذور في جميع غرف جهاز الموائع الدقيقة واسع النطاق. احتضان الجهاز على حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام. في اليوم السابع في المختبر ، قم بإزالة طبق الاستزراع الذي يحتوي على جهاز الموائع الدقيقة من الحاضنة وضعه على مرحلة معقمة.

قم بإعداد مجهر بتكبير 20X وتعقيم منطقة العمل باستخدام 75٪ إيثانول. أمسك طرف ماصة مفلتر معقم سعة 10 ميكرولتر وحدد حزم المحاور العصبية في القنوات الدقيقة الأصلية تحت توجيه المجهر. قم بإجراء خدوش طولية على طول كل حزمة محورية باستخدام طرف الماصة.

راقب كسر المحور العصبي تحت المجهر في الوقت الفعلي. تسمح القنوات الدقيقة لجهاز الموائع الدقيقة القياسي بنمو المحاور ، ولكن ليس سوما ، كما أكد تلطيخ بيتا ثلاثة توبولين في سبعة أيام في المختبر. لم تظهر كثافة الخلايا العصبية فرقا معنوي بعد الإصابة المحورية ، مما يشير إلى عدم وجود موت عصبي ملحوظ.

تم تطوير جهاز موائع دقيقة واسع النطاق بتصميم ثلاثي الأبعاد قابل للتوسيع لتحليلات الميكروميكس. تلتصق كل من النسخ المتماثلة PDMS غير المثقوبة والمثقبة بإحكام بأطباق 10 سم أو لوحات الكمبيوتر. أدى الضرر المحوري الناجم عن خدش طرف الماصة إلى محاور مقطوعة بوضوح مع تعطيل التشكل ، على عكس المحاور السليمة قبل الإصابة.

لوحظ تجديد المحوري في كل من ست ساعات و 24 ساعة بعد الإصابة ، بينما ظلت المحاور غير المصابة مستقرة. ارتفع تركيز البروتين العصبي بشكل ملحوظ من 1420.4 ميكروغرام لكل مليلتر في خط الأساس إلى 1748.9 لكل مليلتر في ست ساعات ، و 1823.7 ميكروغرام لكل مليلتر بعد 24 ساعة من الإصابة. كانت عوائد الحمض النووي الريبي من مجموعات التحكم والمحاور المتطابقة تقريبا.

كشف تسلسل الحمض النووي الريبي عن 595 جينا خاصا بالإصابة و 609 جينا خاصا بالتحكم ، مع 17،471 جينا مشتركا بين المجموعات. حدد تحليل مسار KEGG تنظيما كبيرا للفسفرة المؤكسدة ، واستجابة أنواع الأكسجين التفاعلية ، والالتهام الذاتي ، ومسارات دورة TCA بعد الإصابة.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos