باستخدام رقائق الموائع الدقيقة للتصوير لايف ودراسة الردود الإصابات في ذبابة الفاكهة يرقات

الهدف العام من التجربة التالية هو شل حركة يرقات ذبابة الفاكهة بشكل غير جراحي للتصوير الحي باستخدام غرفة ميكروسويديا معدلة. يتم وضع يرقات النجوم الثالثة في الرقاقة مع بعض الزيت للمساعدة في إغلاق اليرقات. بعد ذلك ، يتم وضع الرقاقة فوق اليرقات بحيث يتناسب جسمها مع الغرفة.

يتم توصيل الشريحة بحقنة بحيث يمكن تطبيق فراغ. تصبح حركة اليرقات مقيدة ، ويتم دفع الهياكل الموجودة في الجزء البطني من بالقرب من زلة الغطاء. باستخدام المجهر متحد البؤر ، يتم تصوير الهياكل بسهولة ، مثل تفاصيل أطراف عصبية الخلايا العصبية الحسية ، وتجديد الأعصاب القطاعية بعد تلف الأعصاب المستحث.

طرق أخرى لشل حركة جوزيفا للتصوير الحي ، أو الأثير الكلوروفورم الضخم ، أو مخدر ISO. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتجنب كمية كبيرة من هذه السموم ، والتي تتداخل مع فسيولوجيا. وفائدة إضافية من غياب السموم هي أن اليرقة GB آمنة وللعمل مع يسمح الشلل القوي بتصوير الأحداث السريعة مثل النقل المحوري الأسرع والتغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا.

يمكن تثبيت يرقة واحدة وتصويرها في الرقاقة عدة مرات. هذا يسمح بحياة الوقت. تصوير العمليات التي تحدث على مدار ما يصل إلى 72 ساعة ابدأ بالحصول على عينة من شريحة PDMS لتجربة هذا البروتوكول.

يمكن قراءة التعليمات حول كيفية صنع شريحة A-P-D-M-S من قالب SU ثمانية في بروتوكول النص باستخدام إبرة توزيع قياس 21. قم بعمل ثقب في منفذ التفريغ لشريحة PDMS للحصول على مجهر مقلوب. قم بإزالة إبرة قياس 23 من قاعدتها ، محور القفل باستخدام بعض التقلبات.

ثم أدخل طرف الإبرة في قطعة صغيرة من أنابيب البولي إيثيلين بحيث يغطي الأنبوب ملليمترا واحدا على الأقل من الإبرة. استخدم شفرة حلاقة لقطع الأنابيب الزائدة. هذا يترك حلقة بلاستيكية يمكن أن تصنع ختما.

أدخل طرف الإبرة قياس 23 في فتحة منفذ التفريغ. للحصول على مجهر مستقيم ، قم بعمل ثقب ثان على جانب شريحة PDMS بإبرة توزيع قياس 21. سيوفر هذا الثقب الوصول إلى الفتحة الأولى من الجانب.

ثم أدخل طرف الإبرة قياس 23 وحلقة الأنبوب في الفتحة الجانبية. ضع قطعة من الشريط على الوجهين فوق الجزء العلوي من شريحة PDMS لإغلاق الفتحة العلوية. قم بتوصيل أنبوب البولي إيثيلين بطول 20 سم بين طرف الإبرة الذي يتم إدخاله في منفذ التفريغ للرقاقة وأحد منافذ الصمام ثلاثي الاتجاهات.

ثم قم بتوصيل حقنة سعة 20 مليلتر في أحد المنفذين المتبقيين للصمام مع ترك المنفذ الأخير مفتوحا. قم بتنظيف شريحة PDMS بشريط لاصق شفاف. نعلق قطعة من الشريط في الجزء السفلي من الشريحة.

تأكد من أن الشريط يلامس سطح PDMS بالكامل ، ثم انزع الشريط. كرر طريقة التنظيف هذه ثلاث مرات. نظرا لأن شريحة PDMS قابلة لإعادة الاستخدام ، فمن المهم جدا إزالة بقايا الزيت لأنها يمكن أن تؤثر على التصاق PDM بالزجاج نقل البحث المبكر عن الطعام.

يرقات الطور الثالث من الطعام إلى طبق بتري يحتوي على الماء. يجب أن يتراوح طولها بين 3.5 وأربعة ملليمترات لتناسب الشريحة بشكل صحيح. استحم اليرقات لإزالة وسط الاستزراع.

بعد ذلك ، يلعب قطرة صغيرة من زيت هالة الكربون 700 في وسط زلة غطاء زجاجي باستخدام ملقط يلتقط يرقات مغسولة برفق. ضعه لفترة وجيزة على منديل خفيف الوزن لإزالته من المنشفة ، ثم انقله إلى الزيت لمدة 10 ثوان. يجب أن يكون القطرة صغيرة بما يكفي بحيث لا تكون القصبة الهوائية لليرقات مغلفة.

ثم ضع اليرقات على غطاء زجاجي نظيف ، وانزلق لفترة وجيزة ، ثم انقله إلى زلة غطاء أخرى. وبالتالي إزالة المزيد من الزيت. انتبه إلى اتجاه اليرقات لتصوير الحبل العصبي والأعصاب المقطعية.

يجب أن يكون الجانب البطني لأسفل. يجب أن تكون أنابيب القصبة الهوائية التي تم تحديدها بسهولة لأعلى. الآن ضع شريحة PDMS برفق فوق اليرقات.

قم بمحاذاة اليرقات مع مركز الغرفة الصغيرة. مع توجيهها الخلفي نحو منفذ التفريغ ، يجب ألا تلمس اليرقة حواف الغرفة. بمجرد المحاذاة ، ادفع شريحة PDMS على زلة الغطاء الزجاجي لتحقيق ختم جيد.

ثم تحقق جيدا من أن اليرقات محاطة بالكامل في الغرفة الصغيرة. الآن قم بتبديل الصمام ثلاثي الاتجاهات إلى المحقنة. أمسك مجموعة PDMS بقوة واسحب مكبس المحقنة لسحب اثنين إلى 2.5 ملم من الهواء حتى تشعر بالمقاومة.

وبالتالي خلق فراغ. ثم قم بإيقاف تشغيل الصمام. للحفاظ على الفراغ بعناية ، تحقق مرة أخرى من اليرقات.

يجب تجميد جسمه داخل الغرفة الصغيرة ، ويجب أن تكون القصبة الهوائية مرئية. يجب أن تكون بقية شريحة PDMS على اتصال مع زلة الغطاء ، والاتجاهات مثل هذه غير صحيحة. الآن تخيل اليرقات.

إذا كنت تستخدم مجهر عمودي ، فقم بتثبيت الجانب العلوي من الشريحة على المسرح بشريط على الوجهين. عند اكتمال التصوير ، حرر الفراغ. ثم افصل شريحة PDMS عن زلة الغطاء.

يجب أن تكون اليرقة متحركة على الفور باستخدام الملقط. أعد اليرقات إلى طبق أجار عصير العنب للتعافي. ضع يرقة واحدة مخدرة على طبق أجار عصير العنب.

تحت المجهر الاستريو ، اقلب الجانب البطني للحيوان لأعلى. لتصور الحبل العصبي البطني والأعصاب المقطعية ، تأكد من أن اليرقة غير متحركة تماما. حدد موقع الحبل العصبي والغدد اللعابية.

المهم عدم إتلاف هذه الهياكل. حدد نهاية الجزء الثالث من البطن. الإصابة هنا تلحق الضرر بمعظم الأعصاب وهي الأسهل في التكاثر دون قتل.

يمكن أيضا إجراء الإصابة في أجزاء خلفية أكثر باستخدام نجمة ثنائية رقم خمسة ، ملقط. اضغط على الأعصاب المقطعية بإحكام من خلال البشرة لمدة خمس إلى 10 ثوان. عند القيام بذلك بشكل صحيح ، تظل البشرة سليمة ولا يتم ثقب جدار الجسم.

سيستغرق الإتقان الممارسة بعد أن وضعت الإصابة الجانب البطني للحيوان لأسفل على اللوحة الكبيرة. يجب أن تكون قادرة على تحريك رأسها وتناول الطعام. إذا نجحت الإصابة ، فسوف يصاب النصف الخلفي من اليرقات بالشلل.

تم استخدام رقاقة اليرقة لتصوير النقل بوساطة كينيسين للحويصلات المشبكية داخل المحاور الطرفية الفردية. تم قياس حركة الصف المعوي لهذه الحويصلات بحوالي 1.0 ميكرون في الثانية. تم تسجيل الحركة الرجعية بسرعة 0.8 ميكرون في الثانية.

تم استخدام تقنية الشلل في الجراحة المجهرية بالليزر باستخدام ليزر صبغ الأشعة فوق البنفسجية النبضي. لوحظت مستويات الكالسيوم في خلايا عصبية محددة بفضل مؤشر مشفر وراثيا. G camp 3.0 يتم الكشف عن ارتفاع الكالسيوم بعد الخلايا العصبية الحسية.

التغصنات مقطعة. يسمح السماح للحيوان بالراحة بين جلسات التصوير بمشاهدة الأحداث الخلوية بمرور الوقت. بعد سحق محاور الخلايا العصبية الحركية العاجلة ، خضع جذع المحور العصبي القريب لإنبات جديد.

وفي الوقت نفسه ، شكلت المحاور البعيدة الدوالي وأصبحت مجزأة من خلال عملية تنكس الحائط. من الممكن أيضا استخدام بروتينات الفلورسنت المحولة لتتبع رقاقة اليرقة في الجسم الحي. تم تحويل بروتين اندماج DRA اثنين من ألفا توبولين معبرا عنه في الخلايا العصبية الحسية من الفئة الرابعة في أجسام الخلايا.

في غضون يومين ، تم نقل كمية كبيرة من البروتين المحول ضوئيا إلى الأطراف المحورية للخلايا العصبية الحسية على بعد حوالي ملليمتر واحد من الموقع الأصلي في جسم الخلية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام شريحة اليرقات للتصوير المباشر ليرقات ذبابة الفاكهة وكيفية إجراء إصابة سحق الأعصاب. بمجرد إتقان هذه التقنيات ، يمكن وضع اليرقات على المجهر في بضع دقائق فقط.

سحق الأعصاب بنفس السرعة. لذلك ، يمكن استخدام هذه الإجراءات في تجارب واسعة النطاق ، مثل الدرجات الوراثية. يمكن استخدام الرقاقة لتصوير الهياكل على الجانب البطني من ذبابة الفاكهة.

وتشمل هذه على سبيل المثال لا الحصر العضلات ، ومشابك التوصيل العصبية العضلية ، والخلايا العصبية الحسية ، والأعصاب الطرفية ، والحبل العصبي البطني. يمكن أيضا استخدام هذا الإجراء لإجراء تصوير حي لليرقات والقلب والغدد اللعابية والقصبة الهوائية. رقاقة اليرقة المستخدمة في هذا الفيديو بحجم التي يتراوح طولها بين 3.5 وأربعة ملليمترات.

للتصوير أصغر أو أكبر ، يمكن بسهولة صنع رقاقة بغرفة أصغر أو أكبر. راجع ملف التصميم التكميلي والتعليمات لصنع رقائق PDMS. يتم تضمين التعليمات الخاصة بعمل رقائق PDMS في البروتوكول المكتوب.

يمكننا أن نرسل لك عينة رقاقة إذا اتصلت بنا.