استكشاف تطبيق الاستشعار الحيوي القائم على تشتت رامان المعزز على السطح لوحدات الطيران الفردية في تشخيص الأمراض والعلاجات
March 13th, 2026
هنا، نقدم بروتوكولا لتحليل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) باستخدام مطيافية رامان المحسنة على السطح (SERS) بدون ملصقات، مما يمكن من تشخيص الأمراض طالية التوغل وتقييم الحويصلات الكهربائية كوسيلة لتوصيل العلاج.
نستخدم تشتت رامان المعزز على السطح مع التعلم الآلي لمعالجة التشخيصات المبكرة للسرطان، وأيضا تقديم تطبيقات طبية حيوية. أحد التحديات التجريبية الرئيسية هو التغاير الفطري في عينات الإكسوسومات، وهي البيانات الطيفية المعقدة للغاية والأبعاد العالية، والتي تتفاقم بسبب انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء. للبدء، قم بعمل الماصة حوالي خمسة ميكرولتر من عينة الحويصلة الصغيرة خارج الخلية على الركيزة البلازمونية المحددة.
ضع الركيزة في مجفف لتجف القطرة تماما لمدة حوالي 15 دقيقة. ثم انقل الركيزة المجففة إلى مجهر رامان كونفوكلي. باستخدام برنامج الأدوات WiRE الإصدار 4.4، ابدأ جمع البيانات.
اضبط ليزر الإثارة على 785 نانومتر عند خمسة مليلي واط وقم بمعايرة النظام. للحصول على أطياف من الركيزة الذهبية، قم بإجراء مسح استطلاعي على مساحة 300 × 300 ميكرومتر لتحديد موقع الحويصلات المفردة باستخدام الوضع الثابت بحجم خطوة 10 ميكرومتر، وتعريض 0.1 ثانية، وبطاقة ليزر 50٪. بمجرد تحديد موقع الحويصلات، قم بإجراء رسم خرائط عالية الدقة في وضع ثابت ضمن شبكة خمسة في خمسة باستخدام حجم خطوة ميكرومتر واحد، وتعريض 0.2 ثانية لكل نقطة، و50٪ من طاقة الليزر.
بعد ذلك، احصل على أطياف من ركيزة الجرافين من خلال إجراء الفحوصات التالية. قم بفحص الأطياف الخام الأولية واستبعاد أي من يعرض ضوضاء مفرطة أو أشكالا طيفية غير طبيعية. تطبيق مرشح سافيتسك-غولاي على كل طيف لتقليل خلفية الفلورة وتنعيم بيانات الطيف.
حساب نسبة الإشارة إلى الضوضاء لكل طيف باستخدام إما طريقة الذروة إلى الأساس أو طريقة الانحراف المعياري. لكل طيف، احسب نسبة الإشارة إلى الضوضاء كنسبة شدة الذروة بعد طرح القاعدة عند نطاق رامان ممثل إلى الانحراف المعياري للضوضاء. تقدير الضوضاء عن طريق طرح نسخة ناعمة من الطيف بنظام سافيتسكي-غولاي، باستخدام حجم نافذة 11 وترتيب كثير الحدود بثلاثة من الطيف الأصلي.
ترتيب جميع الأطياف حسب الترتيب الصاعد لنسبة الإشارة إلى الضوضاء وتقييم استمرار القمم التشخيصية عبر الأطياف المصنفة لتحديد العتبة. ثم اضبط العتبة عند النقطة التي تختفي فيها أي من هذه القمم إلى ضوضاء أساسية تتوافق مع نسبة إشارة إلى ضوضاء 28. استبعد الأطياف التي تقل عن عتبة نسبة الإشارة إلى الضوضاء 28 لضمان الاحتفاظ فقط بالأطياف عالية الجودة للتحليل اللاحق.
وتطبيع كل طيف متبق إما إلى أقصى شدة ذروة له أو المساحة الكلية تحت المنحنى. خصص تسمية لكل قياس طيفي بناء على مصدره، مثل مريض سرطان المعدة أو ضابط سليم. إدخال البيانات الطيفية الموسومة في مصنف متجه داعم مع نواة خطية وتطبيق تقسيم خلط طبقي للتحقق المتبادل الخمسة لضمان تمثيل متوازن في كل طية.
الآن، قم بمتوسط مقاييس الدقة عبر جميع الطيات لتقييم الأداء العام للنموذج. وأخيرا، استخدم التحليل الخطي المميز (LDA) لتقليل أبعاد مجموعة بيانات تشتت رامان المحسنة للسطح للتصور. استخدام نموذج التحليل الخطي المميز المدرب لإجراء تصنيف مباشر بين مجموعات العينة.
كشفت أطياف رامان مع الأطياف المتوسطة المقابلة عن توقيعات جزيئية مميزة عبر كل نوع عينة تم الحصول عليها من حويصلات صغيرة خارج الخلية معزولة من عينات الأنسجة والدم واللعاب. كشف التحليل الخطي المميز عن تجمع واضح لبيانات الحويصلات خارج الخلية حسب الأنسجة أو الدم أو اللعاب الأصلي. التصنيف الثنائي باستخدام مصنف آلة ناقلات الدعم يحقق أعلى دقة لعينات الأنسجة بنسبة 90.1٪، تليها الدم بنسبة 70.9٪ واللعاب بنسبة 60.7٪ في تصنيف LDA يفصل بوضوح عينات السرطان السليمة عن سرطان المعدة في بيانات الحويصلات خارج الخلوية المستمدة من الأنسجة.
أظهرت تقسيمات تصنيف مشابهة قائمة على LDA لبيانات الحويصلات خارج الخلايا المستمدة من الدم واللعاب فصلا أقل مثالية بين العينات الصحية والسرطانية. أظهرت أطياف رامان لحويصلات حضانة دوكسوروبيسين بدون جرافين قمم ثابتة عند حوالي 1,081، 1,206، و1,440 سنتيمتر معكوس. مع الجرافين، لوحظت قمة D إضافية عند حوالي 1,350 سنتيمترا عكوسا، وقمة G عند حوالي 1,580 سنتيمترا معكوسا كمعايير داخلية.
ارتفعت نسبة ذروة دوكسوروبيسين عند 442 سنتيمترا معكوسا إلى ذروة الجرافين G مع زيادة تركيزات الأدوية وفترات الحضانة الأطول. لقد أنشأنا بصمة كيميائية حيوية لحويصلة واحدة لتمييز مصادر الأمراض التي تظهر إمكانية التشخيص المبكر. ثلاث مزايا رئيسية لتقنيتنا.
أولا، هو حساس للغاية. ثانيا، إنه غير جراحي. وثالثا، لا يتطلب التحلل أو تفكيك الجسيمات فعليا.
في المستقبل، سنربط الملف الطيفي بالملف البروتيومي، والذي بدوره سيساعد في ربط محتوى الإكسوم بوظائف محددة، مثل الاتصال الخلوي والنقل.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This protocol presents a label-free analytical platform that integrates surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) with machine learning to detect and molecularly profile individual small extracellular vesicles (sEVs). The method enables high-specificity detection and classification of disease states, such as distinguishing gastric cancer from healthy controls, and quantifies drug loading in single vesicles, supporting both diagnostic and therapeutic applications.
Key Study Components
Area of Science
- Analytical chemistry
- Biomedical diagnostics
- Nanotechnology
- Machine learning applications in biosensing
Background
- Small extracellular vesicles (sEVs) are promising biomarkers for disease diagnosis and therapeutic monitoring.
- Traditional detection methods often require labeling or lysis, which can limit sensitivity and throughput.
- SERS provides molecular fingerprinting capabilities with high sensitivity.
- Machine learning enhances the analysis of complex, high-dimensional spectral data.
Purpose of Study
- To develop a label-free, high-throughput platform for single-vesicle analysis using SERS and machine learning.
- To distinguish between healthy and disease states (e.g., gastric cancer) using sEVs from various biofluids.
- To quantify drug (doxorubicin) loading in individual sEVs for therapeutic assessment.
Methods Used
- Isolation of sEVs via size exclusion chromatography or ultracentrifugation.
- Deposition of sEVs onto engineered plasmonic gold nanopyramid 2D array substrates.
- SERS data acquisition using a confocal Raman microscope with specific laser settings and mapping protocols.
- Preprocessing of spectra (noise filtering, normalization, signal-to-noise thresholding).
- Machine learning analysis using support vector classifiers (SVC) and linear discriminant analysis (LDA) for classification and visualization.
- Use of graphene-coated substrates as internal standards for drug quantification.
Main Results
- Distinct molecular signatures were observed for sEVs from tissue, blood, and saliva.
- Classification accuracies for distinguishing gastric cancer from healthy controls were 90.1% (tissue), 70.9% (blood), and 60.7% (saliva).
- LDA revealed clear clustering of sEVs by source and disease state, especially for tissue-derived samples.
- Quantification of doxorubicin loading in single sEVs was achieved, with graphene peaks serving as internal standards.
Conclusions
- The platform enables sensitive, non-invasive, and label-free detection of sEVs at the single-vesicle level.
- It allows for high-throughput analysis and captures population heterogeneity, aiding early disease detection.
- The method supports both diagnostic and therapeutic applications, including drug loading assessment.
