طريقة الميكروبيدات المغناطيسية السريعة للتنقية الفعالة للعدلات منخفضة الكثافة
نوفمبر 11, 2025
تزداد العدلات منخفضة الكثافة (LDN) بشكل كبير في العديد من الأمراض. عادة ما يتم عزل LDN من خلال فرز الخلايا. نقدم طريقة عملية للحصول على LDN نقي وقابل للحياة. بعد الطرد المركزي المتدرج للكثافة للدم المحيطي ، يتم تحضين الخلايا بميكروبيدات مغناطيسية ، ثم يتم فصل LDN من خلال أعمدة مغناطيسية.
ندرس العدلات منخفضة الكثافة داخل خلايا الدم أحادية النواة الطرفية لتوصيف وظائفها وتحديد دورها في الأمراض المختلفة. العدلات منخفضة الكثافة نادرة في الدم السليم، لكنها تزداد بشكل ملحوظ في أمراض مثل الذئبة الحمراء الجهازية والسرطان. للبدء، أضف 10 وحدات لكل ملليلتر من الهيبارين كمضاد للتخثر في أنبوب طرد مركزي مخروطي بحجم 15 ملليتر.
ثم أضف ملليلترين من 6٪ ديكستران T500 في PBS. احصل على 10 ملليلتر من دم من متطوع بالغ سليم عن طريق الوردة الوريدية. في أنبوب طرد مركزي جديد آخر بسعة 15 ملليتر، أضف خمسة مليليتر من وسط تدرج الكثافة.
قم بعمل الماصة بعناية دون لمس كريات الدم الحمراء وطبقها فوق الوسط لتشكيل مرحلتين منفصلتين. قم بطرد المركزي في الأنبوب عند 516 جرام لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. لعزل PBMCs، يتم سحب وتخلص البلازما فوق نطاق PBMC دون إزعاج الخلايا.
اجمع نطاق الخلية أحادية النواة بين البلازما والوسط، مما يقلل من تجمع الوسط. أضف 20 ملليلتر من PBS إلى الأنبوب الذي يحتوي على PBMCs، ثم استخدم الطرد المركزي بحرارة 400 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. استنشق السائل العلوي بحذر وكشط الأنبوب لفصل الحبيبة.
أضف 10 ملليلتر من PBS البارد لإعادة تعليق الخلايا. لعزل العدلات، قم بكشط الأنبوب لفصل الخلايا بعد تفريغ الوسط. ثم أضف 10 ملليلتر من PBS البارد.
الآن انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي جديد بسعة 50 ملليلتر وجهاز طرد مركزي. استنشق السوبرناتينت وكشط الأنبوب مرة أخرى. الآن ضع الماصة بمقدار 10 ملليلتر من محلول منخفض التوتر البارد داخل الأنبوب وامزجه بلطف.
اخلط بلطف لمدة دقيقة واحدة بالضبط. أضف بسرعة 10 ملليلتر من محلول البارد عالي التوتر لجعل المحلول متساوي التون. ثم عد العدلات باستخدام غرفة نيوباور وتأكد من أن النقاء أعلى من 95٪، قم بالطرد المركزي بنظام التعليق للحصول على حبيبة خلية.
ثم أعد تعليق الحبيبات في PBS البارد. قم بطرد مركزي خلايا الدم المحيطية أحادية النواة عند 400 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد إزالة السوبرناتان، أعد تعليق الخلايا في 120 ميكرولتر من محلول الغسيل البارد.
ثم قم بتوصيل 35 ميكرولتر من الميكروبيدات المغناطيسية CD66b إلى تعليق الخلية. حضن الخليط في الظلام عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. الآن استخدم ماصة ملليتر واحد من محلول الغسل البارد على الأنبوب.
قم بطرد مركزي الأنبوب بقوة 400 جرام لمدة ثلاث دقائق. كشط الأنبوب لفصل حبيبات الخلية بعد إزالة السوبرناتان. وإعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من محلول الغسيل.
ضع عمود فاصل مغناطيسي على مغناطيس. أضف 0.5 ملليلتر من محلول الغسيل إلى العمود، مما يسمح له بالمرور بالكامل. انقل ملليتر واحد من الخلايا المعلقة إلى العمود ودع المخزن يمر قطرة قطرة.
بعد الغسيل، انقل العمود إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. ثم قم بعمل ماصة بميضية واحدة مليلتر من مخزن الغسيل في العمود. الآن ضع المكبس فوق العمود.
اضغط بلطف لخروج الخلايا. ثم أزل المكبس وضع العمود على أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. أضف ملليتر آخر من حاجز الغسيل إلى العمود.
ثم أدخل المكبس مرة أخرى واضغط بلطف لإزالة الخلايا المتبقية. قم بالطرد المركزي في أنبوبي الطرد المركزي الدقيق بوزن 800 جرام لمدة ثلاث دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلايا من كلا الأنبوبين إلى ملليلتر واحد من PBS البارد.
أبق الزنزانة معلقة على الثلج. أعد تعليق الخلايا المنقاة في مخزن وسم مصنوع من مصل البقري الجيني بنسبة 1٪ في PBS. انقل 250 ميكرولتر من نظام التعليق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليتر.
أضف الأجسام المضادة المقابلة ضد جزيئات غشاء العدلات إلى الأنبوب. ثم حضن الخلايا لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية، محمية من الضوء. الآن استخدم الماصة بميلي لتر واحد من PBS إلى الأنبوب.
قم بتدوير الأنبوب في جهاز طرد مركزي دقيق بوزن 800 جرام لمدة ثلاث دقائق. استنشق السوبرناتانت. اضغط على الأنبوب لكسر الحبيبة.
وإعادة تعليق الخلايا في 0.5 ملليلتر من 1٪ بارافورمالديهايد. ثم أبق الخلايا عند أربع درجات مئوية، محمية من الضوء حتى يتم تحليلها بواسطة قياس خلوي التدفق. تحليل العينات باستخدام قياس تدفق الخلويات، مع التقاط 10,000 حدث لكل عينة.
مثلت العدلات منخفضة الكثافة لدى الأفراد الأصحاء حوالي 5٪ من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة، بينما أسفر بروتوكول العزل المغناطيسي الموصوف عن عدلات منخفضة الكثافة عند حوالي 98٪ من التعافي. تعبر العدلات عن علامات الغشاء CD10، CD11b، CD15، CD62L، وCD66b. تعبر العدلات منخفضة الكثافة المنقاء مغناطيسيا عن نفس علامات الغشاء التي تعبر عنها العدلات.
أظهرت العدلات منخفضة الكثافة المنقاء نواة متعددة الفصوص وكانت مشابهة في الحجم للعدلات. كل من العدلات والعدلات منخفضة الكثافة تولد أنواعا تفاعلية من الأكسجين استجابة لتحفيز PMA، بينما تنتج العدلات منخفضة الكثافة مستويات أعلى من النيوتروفيلات. أطلقت العدلات منخفضة الكثافة مصائد خارج الخلايا للعدلات استجابة لتحفيز PMA كما يتضح من تداخل الحمض النووي مع الإيلاستاز والسيترولين.
كل من العدلات المنقاء والعدلات منخفضة الكثافة أطلقت NETs ذات حركية وكميات متشابهة بعد علاج PMA. يوفر بروتوكولنا طريقة سريعة وقابلة للتكرار للحصول على النيوتروفيلات منخفضة الكثافة نقية ووظيفية للغاية. نعالج نقص بروتوكول موحد وفعال في الوقت لعزل العدلات منخفضة الكثافة من دم الإنسان.
هذا البروتوكول لا يتطلب تدريبا خاصا للآلات المعقدة، كما أنه أكثر اقتصادية وأسرع من FACS.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تركز هذه الدراسة على العدلات منخفضة الكثافة (LDN) الموجودة في الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي، وهي نادرة في الأفراد الأصحاء ولكنها تزيد بشكل كبير في العديد من الأمراض. يقدم المقال طريقة عملية لعزل العدلات منخفضة الكثافة النقية والقابلة للحياة من خلال تقنيات الطرد المركزي على التدرج الكثالي وتقنيات الفصل المغناطيسي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- علم المناعة
الخلفية
- ترتبط العدلات منخفضة الكثافة بأمراض مثل الذئبة الحمامية الجهازية والسرطان.
- يمكن أن يوفر فهم العدلات منخفضة الكثافة رؤى حول أدوارها في آليات المرض.
- عزل العدلات منخفضة الكثافة ضروري لدراسة وظائفها وإمكاناتها العلاجية.
- قد لا تقدم الطرق الحالية لعزل العدلات منخفضة الكثافة خلايا نقية وقابلة للحياة.
غرض الدراسة
- لتوصيف وظائف العدلات منخفضة الكثافة.
- لتحديد دور العدلات منخفضة الكثافة في مختلف الأمراض.
- لتقديم طريقة فعالة لعزل العدلات منخفضة الكثافة من الدم المحيطي.
الطرق المستخدمة
- استخدام الهيبارين كمانع للتخثر في جمع الدم.
- استخدام الدكستران T500 للتدرج الكثالي لفصل.
- حضانة الكرات الدقيقة المغناطيسية لفرزة الخلايا.
- فصل العدلات منخفضة الكثافة باستخدام الأعمدة المغناطيسية.
النتائج الرئيسية
- نجحت الطريقة في عزل العدلات منخفضة الكثافة النقية والقابلة للحياة.
- يمكن توصيف العدلات منخفضة الكثافة لأدوارها الوظيفية في المرض.
- قد يؤدي زيادة فهم العدلات منخفضة الكثافة إلى استراتيجيات علاجية أفضل.
- يمكن تطبيق تقنية العزل في إعدادات بحثية مختلفة.
الاستنتاجات
- عزل العدلات منخفضة الكثافة ضروري لدراسة تأثيرها على الصحة والمرض.
- تعزز الطريقة المعروضة نقاء وقابلية الخلايا المعزولة للحياة.
- يمكن أن يسهم المزيد من البحث على العدلات منخفضة الكثافة في تقدم علم المناعة والنهج العلاجية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of low-density neutrophils (LDN) addresses a critical bottleneck in immunology-focused drug discovery, enabling robust functional studies of disease-associated neutrophil subpopulations. This rapid magnetic-microbead method delivers high-purity, viable LDN, supporting mechanistic de-risking and target validation in autoimmune, oncology, and infectious disease pipelines. Scalable, reproducible LDN purification enhances predictive confidence for translational biomarker and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of LDN-mediated disease mechanisms and immune pathway clarification.
- Supports biological de-risking by isolating functionally intact LDN for hypothesis testing.
- Facilitates target validation by providing pure cell populations for downstream assays.
Screening & Assay Development
- Prepares validated LDN samples for quantitative flow cytometry and functional assays.
- Improves assay reproducibility and standardization through high-purity cell isolation.
- Accelerates screening readiness by reducing isolation time and preserving cell viability.
Translational & Preclinical Research
- Enables disease-relevant functional studies of LDN in autoimmune, cancer, and infection models.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by providing scalable LDN yields.
- Facilitates omics and biomarker analyses aligned with translational research objectives.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling rapid, reproducible LDN isolation for mechanistic studies, assay development, and translational research.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing and immune pathway analysis using purified LDN.
- Screening: Delivers standardized, viable LDN for quantitative flow cytometry and functional readouts.
- Analytics: Supports robust measurement of LDN marker expression and functional outputs such as ROS and NET formation.
- Translational Research: Aligns with biomarker and disease model development by enabling scalable LDN purification.
- Enterprise Reuse: Offers a reproducible, time-efficient protocol adaptable across disease areas and research teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune cell studies.
- Operational Value: Standardizes LDN isolation, improving reproducibility and scalability for high-throughput workflows.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in immunology portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immune targets and translational biomarker programs.
Implementation Considerations
- Requires basic cell biology expertise and standard laboratory instrumentation.
- Utilizes magnetic separation columns and flow cytometry for validation.
- Enables cross-team standardization due to protocol simplicity and reproducibility.
- Adaptable to various disease models and sample volumes for scalable studies.
- Limited by the need for specific antibodies and magnetic bead reagents.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:26
Isolation of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) and Neutrophils from Human Blood
2:55
Purification of Low-Density Neutrophils (LDNs) Using Magnetic Microbeads
4:59
Multicolor Flow Cytometry Staining and Analysis of Purified Neutrophils
6:13
Results
7:43
Conclusion
