繁殖与断奶的基本原理

此处描述的所有动物实验操作必须遵循机构动物伦理指南，并经机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。所有操作必须遵守“3R”原则——替代（Replacement）、减少（Reduction）和优化（Refinement），并由经过培训的人员执行。

1. 配对动物时所需的信息包括使用正确命名法的动物品系/种群、种雄和种雌的出生日期，以及配对设置日期。对于繁殖群体而言，准确的记录至关重要。

2. 小鼠和大鼠的性别鉴定通过比较肛门生殖器距离来进行。雌性个体的肛门与外生殖器之间的距离比雄性个体短。雄性动物存在阴囊囊是另一个性别特征。

3. 选择并设置交配方案
注意： 可采用两种交配方案。

1. 动情前期/动情期定时交配：该方法依赖于在雌性动物接受性和生育能力达到高峰时，将其与雄性动物配对。
   1. 必须通过对外阴部进行肉眼观察，检查是否出现提示动情前期和动情期的形态变化，或通过阴道分泌物的细胞学检查（见下文），来监测雌性动物的动情周期。
   2. 当确定雌性处于动情前期或动情期时，应在当天傍晚将其与雄性动物配对，因为动物通常在夜间交配。
   3. 次日早晨检查雌性是否有交配栓（见下文）。若未发现交配栓，可让雌性继续与雄性同笼至白天，并在当天傍晚再次检查是否形成交配栓。或者，若确定其已不再处于动情前期或动情期，则将其从繁殖笼中移除。
2. 随机定时交配：该方法基于啮齿类动物动情周期非常短（4–5天）的特点。
   1. 采用此方法时，可在任意时间设置交配，之后每天早晨和傍晚均检查雌性是否有交配栓，直至观察到交配栓为止。
   2. 于傍晚将雌性与雄性配对。
   3. 自配对日起，每日早晚均检查是否出现交配栓。采用此方法时，通常需要3天或更长时间才能观察到交配栓。

4. 预测妊娠

由于在妊娠早期难以通过触诊检测幼崽，直到妊娠约第10至12天时才较为可行，因此已开发出用于啮齿类动物的商用超声系统；然而，目前很少有动物研究机构配备此类技术。因此，通常通过观察交配栓的形成、阴道变化或进行阴道细胞学检查来辅助判断雌性是否已成功受孕（见下文）。然而，这些方法均无法确认是否真正怀孕。一旦观察到交配栓，应持续监测雌性是否出现怀孕迹象，例如体重增加。

5. 确定动情周期阶段

1. 视觉检查
   ​注意： 对于小鼠和大鼠的定时交配，通过肉眼观察阴道区域的变化以判断动情周期中的动情前期和动情期，是确定动情周期阶段的最快方法，且无需特殊设备。
   1. 使用视觉法评估动情周期时，应在相同光照条件的区域内进行观察，因为光源可能改变阴道组织颜色的视觉感知，从而增加评估难度。例如，LED灯发出的紫色光会使视觉识别更加困难。
   2. 通过视觉观察评估动情周期阶段时，可短暂固定动物以便检查。在可能的情况下，应遵循当前机构指南，采用低应激操作方法（如使用隧道或手捧法），以尽量减少动物应激。可让动物前肢置于笼盖上，以方便观察阴道开口。
   3. 根据阴道周围组织的状态及阴道开口的大小，评估每只雌性动物的阴道开口。
      1. 在动情前期，阴道开口较宽，周围组织肿胀，组织呈粉红色且湿润明显，开口背侧和腹侧边缘常可见皱褶或条纹状结构。
      2. 在动情期，阴道开口周围组织的肿胀程度减轻，组织湿润度和粉红色均减弱。
      3. 在动情后期，阴道开口极小，几乎无肿胀。
      4. 在动情间期，阴道区域周围组织无肿胀，阴道开口小且闭合。
2. 阴道细胞学检查
   由于小鼠和大鼠均为多动情周期动物，其动情周期非常短，通常为4–5天。有时需要识别动情周期的全部四个阶段：动情前期、动情期、动情后期和动情间期。阴道细胞学是一种非常准确的判断方法。样本采集有两种方式：非侵入性的阴道灌洗法和侵入性的阴道道棉拭子涂片法。
   1. 阴道灌洗
      1. 所需材料包括无菌200 µl移液器吸头、乳胶球、无菌双蒸水（ddH₂O）和洁净的玻璃载玻片。
      2. 将乳胶球连接至无菌200 µl吸头末端，吸取约100 µl无菌ddH₂O至移液器中。
      3. 短暂将小鼠从笼中取出，并轻柔固定，以便接触阴道开口。应尽量缩短操作时间，并在可能的情况下采用低应激操作方法。
      4. 将动物摆放至前肢置于笼盖上的位置，以方便操作。
      5. 若小鼠排尿，需等待排尿结束。若阴道道口残留尿液，可用少量ddH₂O冲洗开口处，并更换用于冲洗的吸头。
      6. 将装有ddH₂O的吸头末端置于阴道道口处，但不得插入开口内。
      7. 轻压乳胶球，将约四分之一至一半体积的液体（约25–50 µl）排出至阴道道口。液体将自发吸入阴道道内而无需插入吸头。随后缓慢释放对乳胶球施加的压力，使液体回流至吸头中。
      8. 避免过快释放压力，以防液体被吸入乳胶球内。使用带滤芯的吸头可能有助于避免此问题。
      9. 使用同一吸头、乳胶球和液体重复上述步骤4–5次，以在单一样本中获得足够数量的细胞。
      10. 将收集的液体滴于玻璃载玻片上，并在室温下使其完全干燥。
      11. 每只小鼠应使用新的移液器吸头。
      12. 干燥后，这些动情期涂片可立即染色，也可储存后择期染色。最常用的染色方法为Wright-Giemsa染色。该染色剂可作为一步法商品化试剂使用，无需固定载玻片即可防止染色过程中细胞脱落。根据制造商说明，将载玻片置于染液中染色45–60秒。
      13. 随后在显微镜下观察载玻片，所见细胞类型对应于周期阶段：1）若雌性处于动情前期，可见成簇的圆形、形态完整的有核上皮细胞，其细胞核染色较细胞质深；2）若处于动情期，主要为无细胞核、外形呈多角状、密集堆积的角化鳞状上皮细胞；3）若处于动情后期，细胞通常为白细胞（特别是中性粒细胞），并伴有少量角化鳞状上皮细胞，其细胞核染色深，呈两个相连香肠状；4）在动情间期，主要为白细胞，偶见少量有核上皮细胞。
   2. 阴道拭子取样
      1. 所需材料包括直径为2 mm的无菌棉签、洁净的玻璃显微镜载玻片和无菌生理盐水。
      2. 用生理盐水润湿棉签头部。
      3. 将棉签头插入被固定的小鼠阴道内。
      4. 轻柔旋转并滚动棉签头接触阴道壁，然后小心取出棉签。
      5. 通过在载玻片上滚动棉签，将细胞转移至干燥的玻璃载玻片上。
      6. 载玻片干燥后，可用Wright-Giemsa染色剂染色。拭子取样被认为是一种应激性操作，而应激状态下的小鼠可能出现动情周期紊乱。拭子引起的阴道和宫颈刺激可能诱发假孕。若操作不轻柔、固定不当或使用棉签尺寸不适宜，反复取样可能造成阴道黏膜损伤。

图1. 阴道细胞学——啮齿类动物动情周期的不同阶段

6. 观察交配栓

该栓塞物由阴道分泌物和精液组成，交配后可在阴道内持续存在12-24小时。栓塞物的出现可确认交配已发生，但不能保证雌性动物已怀孕。如果带有栓塞物的雌性动物确实怀孕，其妊娠的第一天被视为发现栓塞物的次日。

1. 将小鼠从笼中提起，使其背部朝上放置在金属网格笼盖上，尾巴朝向操作者。
2. 在尾巴上方轻轻施加压力，使小鼠背部拱起，以便更清晰地暴露阴道开口。
3. 观察其阴道开口处是否有白色团块。交配栓可能肉眼不易察觉，可借助钝头探针进行确认。
4. 使用探针尖端轻轻插入阴道开口。若存在交配栓，探针在进入阴道开口约0.5 cm内会受到明显阻碍。
5. 每次使用前，探针必须用酒精消毒并完全干燥。

当雌性动物产仔时，应记录出生日期、每窝仔鼠数量、出生总数、断奶数量、雄性与雌性仔鼠的比例以及基因型比例。如果一窝仔鼠的基因型与亲代基因型不符，必须重新检测以确认真实的基因型。

7. 断奶

小鼠和大鼠的妊娠期约为21天。幼崽通常在出生后21至28天断奶。小鼠和大鼠最早可在8周龄时开始繁殖，因此必须在幼龄阶段按性别将幼崽分笼饲养。在强化繁殖方案中，幼崽可能在更早的时间（例如约第20天）断奶，以避免与后续窝仔产生重叠；然而，断奶时间应根据机构指南和动物福利因素来确定。在非强化繁殖情况下，幼崽可继续与母鼠同笼饲养超过20天，通常可达28天。这对许多基因修饰品系具有显著益处。

雄性和雌性幼崽在断奶时应分开饲养。只要条件允许，新断奶的幼崽不应单独饲养。如果一窝幼崽中某一性别的个体仅有一只，应尝试将其与同性别的其他幼崽合笼饲养。可能的饲养方案包括：1）若非密集繁殖笼，单只雌性幼崽可继续与母鼠同笼；2）单只雌性或雄性幼崽可与同龄但来自不同窝的同性别幼崽合笼；3）若亲本为单配对，可将雌性移出笼具，使单只雄性幼崽与父鼠同笼饲养；4）单只雄性幼崽可在5周龄前与雌性同胞幼崽同笼饲养。断奶一周后应再次确认幼崽性别，以避免因性别分隔不当而产生非计划的后代。

断奶后的小鼠和大鼠应每天检查，以确保其生长状况良好。只要条件允许，应将幼崽群养，以促进其正常行为发展并减少应激。尽管《实验动物护理与使用指南》指出，饲料的提供方式必须避免被粪便和尿液污染，但对于刚断奶的小鼠，应在笼底放置一个玻璃皿（如培养皿），其中放入少量饲料（每只小鼠一粒饲料颗粒），以帮助动物顺利过渡到仅以啮齿类动物标准饲料为唯一食物来源。即使对于饲养在通过自动供水系统为笼具供水的架位上的动物，若发现小鼠有脱水迹象，也可在笼内额外添加饮水瓶。

品系名称	繁殖类型	特征描述
ICR	远交系	白化
Swiss-Webster	远交系	白化
Balb/c	近交系	白化
FVB	近交系	白化
C57BL/6	近交系	黑色毛色
C3H	近交系	棕色毛色
DBA/2	近交系	棕/灰色毛色
Athymic nudes (nu/nu)	近交系	无毛
SCID	近交系	严重联合免疫缺陷小鼠，具有多种毛色

品系名称	繁殖类型	特征描述
Sprague-Dawley	远交系	白化
Wistar	远交系	白化
Fisher 344	近交系	白化
Lewis	近交系	白化
Long Evans	近交系	头罩型，黑白相间

表2. 常用的大鼠品系和种群。

图1. 基于孟德尔遗传学的可能交配方式及其结果。 野生型动物未经过基因改造，记为 (+/+)；杂合子动物携带一个拷贝的修饰基因，记为 (-/+)；纯合子动物的两个基因拷贝均被修饰，记为 (-/-)。

关键术语与定义
常见品系与种群类型
小鼠和大鼠通常被培育为远交系种群、近交系品系和杂交系品系。远交系动物具有相似的特征，但在遗传上并不完全相同。它们通过随机交配来维持杂合性或遗传多样性。相比之下，近交系动物经过至少20代的兄妹交配或亲子交配，遗传上高度纯合。最后，杂交系动物是由两个不同的近交系品系交配所产生的后代。
影响繁殖行为的因素
许多因素会影响小鼠和大鼠的繁殖性能。雌性繁殖个体的繁殖活力在很大程度上取决于近交程度。远交系动物通常更为强健、活力更强，因此能产生数量更多、体质更强的仔代。某些常用品系（如C57BL/6小鼠）表现出攻击性行为，可能干扰正常繁殖。在繁殖具有攻击性的品系时，应对所有产仔进行密切观察。若某一窝仔代中出现攻击性个体，则该窝动物不应再用于繁殖。温度、湿度和光照波动均可能导致繁殖效率下降。繁殖室内的噪音和振动也被证实会产生不利影响。在繁殖设施中控制这些变量可最大程度地减少其负面影响。经过遗传修饰的动物通常体质较弱、生育能力较低，某些突变可能导致仔代在出生前或出生后不久死亡。
繁殖方案
小鼠和大鼠的繁殖方案相似。常用的繁殖系统包括单配偶制（一只雌性与一只雄性交配）和多配偶制（两只或更多雌性与一只雄性交配）。小鼠和大鼠均为多动情周期动物，产后约20–24小时可进入产后动情期。在产后动情期内，雌性可再次受孕。对于因基因突变而导致繁殖寿命较短的小鼠或大鼠品系，通常将雄性保留在雌性笼中，使其在分娩后立即再次受孕。这种高强度繁殖方案对雌性动物具有较大压力，因其持续处于哺乳和妊娠状态。非高强度繁殖方案则是在雌性明显怀孕后将其与雄性分离，直至仔代断奶后再重新放入雄性笼中。该方案对雌性动物的压力显著降低。
用于遗传操作目的的繁殖
基因工程动物（GEAs）包括基因敲除动物（其基因组中某些基因被移除）和转基因动物（其基因组中插入了来自其他物种的基因）。这些基因工程动物通常作为近交系进行繁殖，并常与其他基因工程动物交配，以构建用于特定研究项目的复杂遗传修饰动物模型。通过复杂的繁殖方案，可培育出某些基因被敲除而其他基因被插入的品系。通过动物基因工程技术，已成功建立多种基因相关疾病的研究模型，包括但不限于阿尔茨海默病、癌症、中风及其他血液系统疾病、糖尿病和视网膜色素变性等。
大多数繁殖方案可依据孟德尔遗传规律预测基因型比例。当野生型小鼠与携带一个修饰基因的杂合子小鼠交配时，预期后代中50%为野生型，50%为杂合子。野生型小鼠与携带两个修饰基因的纯合子小鼠交配，其所有后代均为杂合子。当两只杂合子动物交配时，后代中三种基因型的比例预期为：25%野生型、50%杂合子和25%纯合子。正是基于这些预期比例，可检测出胚胎致死基因（例如，若未产生纯合子后代，则提示可能存在胚胎致死效应）。

图 2. 基于孟德尔遗传学的可能交配方式及其结果。 野生型动物未经过基因改造，记为 (+/+)。杂合子动物携带一个拷贝的修饰基因，记为 (-/+)；纯合子动物的两个基因拷贝均被修饰，记为 (-/-)。
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内部繁育种群为研究提供了灵活性，尤其适用于使用胚胎或新生动物的研究项目。通过使用定时交配结合阴栓检测和阴道细胞学等技术，可以更准确地预测受孕和妊娠日期，从而使研究人员能够更精确地规划实验。控制光照周期、温度、湿度和振动等环境因素将优化繁育结果。