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非放射性 原位 适用于挪威云杉及多种植物物种的杂交实验方案

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DOI：

10.3791/1205

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2009年4月17日

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1Department of Evolutionary Functional Genomics, Evolutionary Biology Center, Uppsala University, 2Department of Plant Biology and Forest Genetics, Uppsala BioCenter, Swedish University of Agricultural Sciences

本文内容

摘要

我们描述了一种改良的 DIG 原位 杂交实验方案，快速且适用于多种植物物种，包括挪威云杉。只需进行少量调整，如改变RNase处理和蛋白酶K浓度，该方案即可用于不同组织和物种的研究。

摘要

当今可用的高通量表达分析技术为科学家提供了海量的表达谱数据，但由于难以分离个体组织，其在组织特异性表达方面的分辨率受到限制。表达数据需要通过例如表达模式分析进行验证和补充 原位 杂交，一种用于定位细胞特异性mRNA表达的技术。该 原位 杂交方法费时费力，且通常需要根据物种和组织进行大量优化。 原位 实验在木本物种中相对较难进行，例如针叶树种挪威云杉（Picea abies）。本文介绍了一种改良的 DIG 原位 杂交实验方案，快速且适用于多种植物物种，包括 P. abies通过一些调整，包括改变RNase处理和蛋白酶K的浓度，我们即可利用该方案研究一种裸子植物和两种被子植物雄性生殖器官中同源基因的组织特异性表达； P. abies，拟南芥 和 甘蓝型油菜该方案对所研究的物种和基因均表现出同等良好的效果。 AtAP3 和 BnAP3 在第二和第三轮花器官中观察到 拟南芥 和 B. napus 以及雄性球果小孢子叶中的 DAL13 P. abies。对于 P. abies 蛋白酶K的浓度（用于组织通透）需从1 μg/ml提高至3 μg/ml，这可能是由于组织更为致密以及酚类物质和多糖含量较高所致。对于所有物种，均去除了RNase处理步骤，因为该处理导致信号强度减弱，而特异性并未相应提高。通过比较开花植物和一种针叶树中同源基因的组织特异性表达模式，我们证明了DIG 原位 此处介绍的实验方案仅需微小调整即可适用于多种植物物种。因此，本方案避免了针对不同物种进行大量优化，也避免了使用放射性标记探针，转而采用地高辛标记探针。我们选择在视频中展示该方案中技术难度较高的操作步骤。

Anna Karlgren 和 Jenny Carlsson 对本研究的贡献相同。

通讯作者：Anna Karlgren，电子邮箱：Anna.Karlgren@ebc.uu.se；Jens F. Sundström，电子邮箱：Jens.Sundstrom@vbsg.slu.se

方案

这种非放射性mRNA 原位 杂交实验方案已针对挪威云杉组织进行了优化，并进行了详细描述。该方案基于拟南芥/油菜 原位 由我们课题组优化的杂交实验方案，该方案基于Meyerowitz实验室和Irish实验室的已有方案，并由Vivian Irish、Cindy Lincoln和Jeff Long等人进一步优化。 1-4.

实验步骤

1. 固定与包埋

为了保留RNA，组织需要在进行原位杂交实验前进行固定并包埋于石蜡中。in situ 实验前的固定和包埋是关键步骤，因为固定不良的材料即使在mRNA丰度很高的情况下，也可能导致信号微弱或无法检测。组织需经过逐步的脱水、透明和石蜡包埋，以避免组织损伤。为进一步防止细胞收缩或膨胀，在挪威云杉组织脱水过程的初始乙醇步骤中加入了0.85% NaCl。乙醇中可不加NaCl（例如，在拟南芥/油菜的实验方案中即省略了NaCl）。包埋过程中的脱水步骤可在冰上进行，以最大限度地抑制RNase活性，也可在+4°C下进行。本方案中，4%多聚甲醛固定液含有0.25%戊二醛，据称有助于更好地保留RNA，尽管也有观点认为其可能并无显著影响（例如，在拟南芥/油菜的实验方案中即未添加）。大多数标准的固定和包埋方案均可使用。如下所示，挪威云杉的包埋流程与拟南芥/油菜的方案略有不同。

1.1 第1天 采集植物材料并用多聚甲醛固定

  1. 采集目标植物材料，必要时进行解剖。将组织置于冰上，并立即或尽快放入预冷的固定液中（见下文配方）。N.B.！务必始终置于冰上！
  2. 对样品施加真空，直至多聚甲醛开始产生气泡。维持真空最多三小时（例如，拟南芥和油菜花组织为2次×15分钟，挪威云杉雄球花为1小时），然后缓慢释放真空。固定剂经真空渗透后，组织应沉入液体底部，但对于某些含气量较高的组织则可能无法下沉（如拟南芥花朵）。可使用一小块纱布压住组织，使其保持浸没在固定液中。
  3. 更换新鲜固定液，在+4°C条件下轻轻振荡孵育过夜（约12–16小时）。

选项 1

注意！以下是挪威云杉包埋方案（步骤4-8）。在第5步中，务必使用闪烁瓶或玻璃小瓶。

1.2 第2天 脱水 N.B.! 挪威云杉包埋版本。

  1. 0.85% NaCl30 min冰上
    50% EtOH + 0.85% NaCl90 min冰上
    70% EtOH + 0.85% NaCl90 min冰上
    暂停！此时可停止操作，将组织保存在70% EtOH + 0.85% NaCl中，于+4°C条件下可保存数月。
    85% EtOH + 0.85% NaCl90 min+4°C
    95% EtOH (+ eosin)90 min+4°C
    注意！加入伊红可将组织染成粉红色，便于包埋和切片过程中识别，但也可省略。
    100% EtOH (+ eosin)90 min+4°C
    100% EtOH (+ eosin)过夜+4°C

1.3 第3天 脱水与包埋 N.B.! 挪威云杉包埋版本。

  1. 100 % EtOH (+ 伊红)2 h室温
    50% EtOH + 50% Histoclear II1 h室温
    100% Histoclear II1 h室温
    100% Histoclear II1 h室温
    50% Histoclear II + 50% Histowax过夜+40-50°C
    注意！最后一步中 Histowax 的浓度并不关键，只需加入一些石蜡碎片即可。

1.4 第4天 包埋 N.B.! 挪威云杉包埋版本。

  1. 100% 熔融的 Histowax+60°C（每日早晚更换）

1.5 第5天 包埋 N.B.! 挪威云杉包埋版本。

  1. 100% 熔融的 Histowax+60°C（每日早晚更换）

1.6 第6天 包埋 N.B.! 挪威云杉包埋版本。

  1. 100% 熔化的 Histowax+60°C（每日早晚更换）
    注意！若石蜡偶尔每天仅更换一次亦可接受，但此时完成原定一天的更换流程需耗时两天。石蜡更换过程也可无碍地额外延长两天。对于较大的样本，建议采用此方案，因其有助于石蜡充分渗入组织中心。

选项 2

注意！以下为拟南芥/油菜的包埋步骤（第4-8步）。

1.2 第2天 脱水 N.B.! 拟南芥/油菜包埋版本。

  1. 注意！除非另有说明，所有步骤均在 +4°C 下轻柔振荡进行。
    1x PBS30 分钟
    1x PBS30 分钟
    30% EtOH60 分钟
    40% EtOH60 分钟
    50% EtOH60 分钟
    60% EtOH60 分钟
    70% EtOH60 分钟
    暂停！可在此处中断操作，将组织样本置于 70% EtOH 中，在 +4°C 下保存数月。
    85% EtOH60 分钟
    95% EtOH (+ eosin)过夜
    注意！加入伊红可将组织染成粉红色，便于包埋和切片过程中识别，但也可省略此步骤。

1.3 第3天 脱水与包埋 N.B.! 拟南芥/油菜包埋版本。

  1. 注意！除非另有说明，所有步骤均在室温下进行，并轻轻振荡。
    100% 乙醇（+ 伊红）30 分钟
    100% 乙醇（+ 伊红）30 分钟
    100% 乙醇（+ 伊红）60 分钟
    100% 乙醇（+ 伊红）60 分钟
    注意！将组织转移至闪烁瓶或其他（玻璃）瓶中。
    75% 乙醇 + 25% Histoclear II30 分钟
    50% 乙醇 + 50% Histoclear II30 分钟
    25% 乙醇 + 75% Histoclear II30 分钟
    100% Histoclear II60 分钟
    100% Histoclear II60 分钟
    100% Histoclear II + ¼ 体积 Histowax 芯片过夜（不振荡）
    注意！最后一步中 Histowax 的浓度并不关键，只需加入一些石蜡芯片即可。

1.4 第4天 包埋 N.B.! 拟南芥/油菜包埋版本。

  1. 将装有组织的试管置于 +42°C，直至石蜡碎片完全融化。随后加入 ¼ 体积的石蜡碎片，待其完全融化。转移至 +60°C，将试管放置数小时。最后，用新鲜熔化的石蜡/Histoclear II 替换原有溶液，并在 +60°C 下过夜孵育。

1.5 第5天 包埋 N.B.! 拟南芥/油菜包埋版本。

  1. 100% 熔融的 Histowax+60°C（每日早晚更换）

1.6 第6天 包埋 N.B.! 拟南芥/油菜包埋版本。

  1. 100% 熔化的 Histowax+60°C（早晚更换）
    注意！在拟南芥/油菜协议中（与挪威云杉协议相比），第7天的包埋步骤与第5–6天相同，即在 +60°C 下使用 100% 熔化的 Histowax，并于早晚各更换一次。
    注意！若蜡偶尔每天仅更换一次亦可接受，但完成原定每日更换步骤将需要两天时间。蜡的更换也可额外延长两天而无任何问题。对于较大的样品，建议延长更换时间，因其有助于蜡充分渗透至组织中心。

1.7 第7天 包埋（拟南芥/油菜花方案中的第8天）（影片！技术细节见影片）

  1. 将培养皿和/或模具在 +60°C 下预热。打开加热板（+60°C），并确保已有融化的组织学蜡备用。
  2. 将组织和融化的组织学蜡倒入置于加热板上的培养皿（或模具）中。加入更多组织学蜡，使组织完全被覆盖。加热一对镊子，将组织在皿中均匀分散。填满培养皿（或模具）。如果蜡在组织尚未摆放到位前已凝固，可重新加热，或用加热的镊子去除已硬化的蜡。
  3. 将蜡块在室温下冷却固化后，再置于 +4°C 保存。建议制备多个蜡块，避免组织包埋过密，以防切片时蜡块开裂。
    暂停！可在 +4°C 保存，组织可稳定存放数年。
    注意！从本步骤起需保持无 RNase 操作环境。操作时佩戴手套，使用经 DEPC 处理的 MilliQ 水、缓冲液、玻璃器皿等，并在适当情况下对缓冲液进行高压灭菌、对玻璃器皿进行烘烤等处理。

2. 切片（影片！技术细节在影片中展示）

  1. 打开两个加热板（+60°C 和 +42°C），并确保有足够的熔化石蜡（Histowax）。
  2. 加热解剖刀，小心地从培养皿中切出组织的石蜡块（操作过于剧烈可能导致石蜡块开裂），或从模具中取出石蜡块。当单个石蜡块被分离后，将其修整成适合在切片机上切片的大小和形状。
  3. 石蜡块的组织下方应保留一块额外的石蜡“底座”，以便将其固定在样品头（block holder）上。将样品头和石蜡底座在加热板（+60°C）上加热，并将其融合在一起。必要时可添加一滴 Histowax II 以确保连接牢固。随后在 +4°C 下使其冷却固化。
  4. 使用切片机将石蜡块切成厚度为 6–8 μm 的连续切片，形成一条长条状的切片带。
    注意！若石蜡块保持低温，则切片过程会更容易。建议将石蜡块储存在 +4°C 环境中，并在开始切片前从冰箱中取出。保持刀片低温也可能有益。
  5. 在放大镜下观察切片带，标记出可用于后续实验的切片区段。
  6. 在载玻片上加入无 RNase 的 MilliQ 水（使用 Fisher Biotechnology 的 Probe-On Plus 载玻片，该载玻片已预先清洁并带电荷）。将切片带切成较小片段，并将其放置在载玻片上（“背面”或“有光泽面”朝下）。将带有切片的载玻片置于 +42°C 的加热板上。切片应在水中完全展平（这一点非常重要！）。静置数分钟后，使用 Kimwipe 纸巾或滤纸吸去多余水分。
  7. 将载玻片继续留在加热板上 1–2 小时。
  8. 在 +42°C 下孵育载玻片过夜，使组织牢固附着于载玻片上。
    暂停！建议尽快使用这些切片，但若需保存，可将切片干燥后置于密闭盒中，并加入干燥剂，在 +4°C 下保存数天。

3. 探针的制备

原位杂交通过使用针对特定 mRNA 的标记探针来检测表达。该探针通常为一段互补 RNA，可用地高辛（digoxigenin, DIG）进行标记。DIG 是一种小分子，可连接至尿苷，从而掺入 RNA 探针中，随后通过抗 DIG 特异性抗体进行检测。

探针的设计与制备是RNA原位杂交实验中最关键的步骤。应特别注意确保探针具有高特异性，并使用高质量的UTP进行标记。有时需要针对特定探针调整杂交温度和/或反应时间。与常规操作一样，必须注意避免RNase污染。

标记前，根据标准操作流程分离模板，例如使用cDNA克隆、PCR片段，并将模板线性化。使用基因特异性引物从模板中分离并扩增正义链和反义链片段。对于PCR扩增片段，不要使用产生3'突出端的酶。通过带有T7序列的引物或含有T7启动子的载体，向所有片段添加T7（或SP6或T3）突出端。

有义链（mRNA 或 (-) 链）探针与靶 mRNA 序列相同，因此不会与靶 mRNA 杂交；而反义链（anti-mRNA 或 (+) 链）探针具有互补序列，能够与靶 mRNA 杂交，从而产生目标信号。有义链探针用作阴性对照，若实验操作正确，则不应出现信号。同时还需要设置阳性对照，例如检测持家基因的探针。大多数切片应使用反义链探针进行杂交，仅有少数切片需用于与不同的对照探针杂交。

3.1 使用体外转录法进行探针标记

标记探针时使用 DIG RNA 标记试剂盒（SP6/T7；11175025910，Roche Applied Science，德国曼海姆）或类似试剂。本方案中所述的 20 μl 反应体系应产生约 10 μg 的 DIG 标记 RNA。

  1. 制作一个 体外 转录以掺入标记的核苷酸。将以下试剂加入离心管中（置于冰上）：
    成分体积/数量
    10 x NTP 标记混合物2 μl
    10 x 转录缓冲液2 μl
    Protector RNase抑制剂1 μl (20U)
    RNA T7聚合酶（SP6或T3）2 μl
    模板DNA（500-1000 ng）x μl
    无RNase的MilliQ水y μl，定容至最终体积 18 μl
  2. 将NTP标记混合物、转录缓冲液、RNase抑制剂混合 注意：如果探针较短，例如 <500 bp时，可将RNase抑制剂浓度增加至40 U），聚合酶、模板DNA和水，然后短暂离心。
  3. 将反应混合物在 +37°C 2 小时（ 注意！如果探针较短，例如 <500bp，将反应时间延长至4-6小时).
  4. 添加 2 μl DNase I 处理并在 +37°C 15分钟。
  5. 通过添加终止反应 2 μl 0.2 M EDTA（pH 8.0）。在凝胶上检测产物。
  6. 加入沉淀剂使探针沉淀 2.5 μl 4 M LiCl 溶液 75 μl 的 >99.5% 乙醇。充分混匀，于 -20°C 过夜（ 注意：请勿使用tRNA作为载体，而应根据制造商说明使用糖原或丙烯酰胺).
  7. 离心（13 000 rpm）30分钟，温度+4°C 并弃去上清液。用70%乙醇（约150–）将沉淀物洗涤两次（至少10分钟，13,000 rpm）300 μl).
  8. 移除上清液并让沉淀干燥。将探针重悬于 30 μl 无RNase的水，冰上孵育1-2小时。
    暂停！探针可在 -20°C 一年多来。
    注意！保存 0.5 μl 第21步（体外转录前）、第23步（DNase处理前）、第24步（DNase处理后，但沉淀前）的样品以及 1 μl 步骤27中获得的样品（探针已重悬时），在非变性1% TBE琼脂糖凝胶上进行电泳。若DNase反应有效，模板条带应消失。体外转录应产生一条浓密的、大小约正确的RNA条带。若观察到多条条带，将样品在+80°C 5 分钟，然后在上样前于冰上淬灭。如果第 27 步的回收效果不佳，可能是由于探针未充分重悬。将 RNA 在 +55°C 5-10 分钟使其完全溶解。

3.2 长探针的水解

注意：如果您的探针长度超过 150 bp，建议将其缩短至 50–150 bp，以获得较强的信号，原因在于较小的探针穿透性更佳。探针可通过碳酸盐缓冲液（pH 10.2）进行化学降解。若探针长度已符合要求，可跳过水解步骤，但需记得向探针中加入等体积的甲酰胺，即 30 μl。

  1. 配制 0.2 M 碳酸氢钠（NaHCO₃）溶液3）和 0.2 M 碳酸钠（Na2CO3两者均应新鲜。
  2. 通过将5 ml H混合来测试两种缓冲液2O，2 ml 0.2 M NaHCO₃3 和 3 ml 0.2 M Na2CO3pH 应约为 10.2。
  3. 计算孵育时间：
    孵育时间（分钟）= (L0-f) / (K*L0*f)
    L0探针的起始长度（kb）
    Lf = 探针的最终长度（kb）= 例如 0.100 kb
    K = 水解速率常数 = 0.11 kb-1min-1
  4. 将探针的一半进行水解，剩余部分保存以备后续使用。将探针稀释至 50 μl 用无RN酶的水溶解并加入 20 μl 0.2 M NaHCO₃3 （先加入）和 30 μl 0.2 M Na2CO3混合并在 +60°C 根据计算的孵育时间。
  5. 通过添加终止反应 10 μl 1 M NaOAc pH 4.7 溶液
  6. 加入沉淀剂使探针沉淀 10 μl 4 M LiCl2 和 300 μl 乙醇（ 注意：必要时使用糖原或丙烯酰胺作为载体）。于 -20°C 过夜。
  7. 离心（13 000 rpm）30分钟，温度+4°C 并弃去上清液。用70%乙醇洗涤沉淀物两次（约300 μl）。每次洗涤时以13 000 rpm离心至少10分钟，温度为+4°C.
  8. 移去上清液，让沉淀干燥。将探针重悬于 30 μl 无RNase的MilliQ水。加入等体积的甲酰胺，即 30 μl，加入探针。
    暂停！探针可在 -20°C 一年多来。
    注意！取 2 μl 未水解探针的 2 μl 水解探针（在加入甲酰胺之前）的样品，并在1% TBE非变性凝胶上进行检测。两个样本之间应出现大小差异。探针可能需要在+80°C 5 分钟后在冰上淬灭，再进行上样。

4. 原位 杂交（ 影片！技术细节在影片中展示)

确保所有溶液均无RNase！无需对所有物品进行DEPC处理，但至少应使用经高压灭菌的MilliQ水。确保所有玻璃器皿在+200°C下加热过夜或至少5小时。用0.1 M NaOH溶液在振荡条件下处理塑料容器和搅拌子过夜。随后用高压灭菌的MilliQ水（约500 ml/容器）反复冲洗塑料容器数次。必须仔细冲洗容器，以避免残留NaOH痕迹，否则可能干扰杂交反应。除Tris缓冲液外，所有储备溶液均需进行DEPC处理。在开始实验前检查所有溶液等，确保所有物品均已备齐。从步骤1至步骤61（除步骤51-52外），我们将载玻片置于一个可轻松在不同容器间移动的支架中。

4.1 原位 切片预处理

  1. 脱蜡/脱水切片：
    2次，每次10分钟，使用Histoclear II（使用玻璃容器）
    2次，每次1–2分钟，100% EtOH
    1–2分钟，95% EtOH
    1–2分钟，90% EtOH
    1–2分钟，80% EtOH
    1–2分钟，60% EtOH
    1–2分钟，30% EtOH
    1–2分钟，H2O
  2. 在室温下用2x SSC洗涤载玻片15–20分钟（注意！在孵育期间准备第42步中使用的多聚甲醛）。
  3. 在+37°C下以蛋白酶K处理组织30分钟，并轻轻振荡（例如，拟南芥/油菜为1 μg/ml，挪威云杉为3 μg/ml）。将100 mM Tris（pH 8）和50 mM EDTA混合并预热至+37°C。在处理载玻片前立即加入蛋白酶K。注意！蛋白酶K处理条件需根据组织类型、植物种类和发育阶段进行优化。（注意！在孵育期间准备第45步中使用的三乙醇胺）。
  4. 在室温下用1x PBS中的2 mg/ml甘氨酸处理载玻片2分钟。（注意！应在使用前一天将甘氨酸与PBS混合，以确保甘氨酸充分溶解）。
  5. 在室温下用1x PBS洗涤载玻片2分钟。
  6. 在室温下用1x PBS洗涤载玻片2分钟。
  7. 在室温下用新鲜配制的含4%（w/v）多聚甲醛的1x PBS（pH 7）孵育载玻片10分钟。使用玻璃容器。
  8. 在室温下用1x PBS洗涤载玻片5分钟。
  9. 在室温下用1x PBS洗涤载玻片5分钟。（在第45步中将乙酸酐加入溶液中）。
  10. 在室温下用新鲜配制的0.1 M三乙醇胺（pH 8）和乙酸酐孵育载玻片10分钟。
  11. 在室温下用1x PBS洗涤载玻片5分钟。
  12. 在室温下用1x PBS洗涤载玻片5分钟。
  13. 脱水：
    30秒，30% EtOH
    30秒，60% EtOH
    30秒，80% EtOH
    30秒，90% EtOH
    30秒，95% EtOH
    2次，每次30秒，100% EtOH
    暂停！可在此处停止，将载玻片置于底部含有少量EtOH的容器中，在+4°C下保存数小时。

4.2 原位 杂交（ 影片！技术细节在影片中展示)

确定每种探针所使用的载玻片，注意同时使用正义链和反义链探针，并设置阳性对照。（注意！Fisher Biotechnology 的 ProbeOn Plus 载玻片带有白色磨砂面，可在实验方案的杂交/检测步骤中将载玻片成对夹合使用。）同一对载玻片应使用相同种类和浓度的探针。根据载玻片对的总数确定所需杂交液的配制量。将硫酸葡聚糖预先在 +60°C 下加热。由于含有硫酸葡聚糖，杂交液非常黏稠，将其置于 +60°C 环境中可使其更易于操作。在加样前，将载玻片置于洁净的纸巾或 Kimwipe/擦拭纸上空气干燥，确保载玻片完全干燥。为每对载玻片加入探针。在正式实验前，务必测试不同的探针浓度（例如 0.5、2 和 4 μl），以确定最佳浓度。

杂交溶液5 对载玻片10 对载玻片15 对载玻片20 对载玻片
10xin situ 盐溶液100 μl200 μl300 μl400 μl
去离子甲酰胺400 μl800 μl1200 μl1600 μl
50 % 硫酸葡聚糖 (+60 °C)200 μl400 μl600 μl800 μl
50x Denhardt 溶液20 μl40 μl60 μl80 μl
tRNA (100 mg/ml)10 μl20 μl30 μl40 μl
H2O (DEPC 处理)70 μl140 μl210 μl280 μl
总体积800 μl1600 μl2400 μl3200 μl
  1. 将探针用无RNase的MilliQ水稀释至终体积为20 μl。向探针中加入等体积（即20 μl）的甲酰胺，使总体积达到40 μl。将探针在80°C下加热2分钟，随后置于冰上冷却2分钟。短暂离心，收集液体。探针保持在冰上备用。此探针混合液足够用于一对载玻片。根据特定探针所需的载玻片对总数，按比例放大配制。
  2. 每对载玻片加入160 μl杂交液，使每对载玻片的终体积为200 μl（即160 μl杂交液 + 40 μl探针）。轻轻混匀，避免产生气泡。
  3. 将探针加至一张载玻片上，然后缓慢将两张载玻片压合在一起。（注意！仅可使用Probe-On Plus载玻片或同类载玻片进行压片操作。若使用无磨砂面的载玻片，则应使用盖玻片代替压片方式。）
  4. 用塑料移液管将载玻片架高，置于铺有湿润纸巾的塑料容器（密封良好）内，在+50–55°C条件下过夜杂交（12–16小时）。

4.3 原位杂交后处理（影片！技术细节见视频）

  1. 制备 原位 杂交后通过加热约2 L的0.2x SSC（+55°C）和约 2 L 1x NTE（+37°C）过夜。如果进行RNase处理（如下步骤57-59），则需要更多的SSC和NTE。
  2. 将每对载玻片浸入预热的0.2x SSC溶液（见上文）中，以分离并冲洗载玻片。随后将其放入盛有预热0.2x SSC溶液的容器中的染色架内。
  3. 将载玻片在 +37 °C 下用 0.2x SSC 轻柔振荡洗涤 60 分钟55°C. ( 注意：在孵育期间，准备步骤63中使用的Boehringer封闭溶液。)
  4. 用 0.2x SSC 缓冲液再次洗涤 60 分钟。 注意：如果进行RNase步骤，请在此孵育期间让RNase自然解冻；若不进行，请继续至第60步。)
  5. 可选：在 +37 °C 下，用温热的 1x NTE 缓冲液（见上文）洗涤载玻片 5 分钟37°C 轻柔振荡。
  6. 可选：在温热的1x NTE缓冲液中重复洗涤5分钟，温度为+37°C 轻柔振荡。
  7. 可选：用 RNase 处理载玻片（20 μg/ml RNase A 溶于1x NTE，+30°C孵育30分钟37°C 轻柔振荡。然后在 +1x NTE 中洗涤 5 分钟37°C 轻柔振荡。重复一次1x NTE洗涤。
  8. 将载玻片在 +60 分钟内用 0.2x SSC 洗涤55°C 轻柔振荡。 注意：在孵育期间配制步骤64-65和67中使用的封闭液。)
  9. 在室温下用 1x PBS 清洗载玻片 5 分钟暂停！可将载玻片置于1×PBS中，于+4 °C保存。4°C 如果需要在第二天继续实验，可过夜放置。)
  10. 将载玻片样品面向上放置于大型塑料容器底部。
  11. 在室温下，用含有1% Boehringer封闭剂的100 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl溶液轻柔振荡孵育载玻片45分钟。封闭液用量以刚好覆盖载玻片为宜。倾去封闭液时，载玻片仍保留在塑料容器中，或将其转移至新的容器中。倾倒过程中，载玻片通常会附着在塑料容器上，但需确保其不从容器中脱落。
  12. 用含1.0% BSA、100 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl和0.3% Triton X-100的溶液替换Boehringer封闭液。按照步骤63进行孵育。
  13. 稀释抗地高辛抗体（1:1250，即 8 μl 在步骤64的BSA/Tris/NaCl/Triton溶液中加入10 ml BSA中的抗体。将抗体溶液滴加至塑料称量皿中形成液滴。将载玻片成对叠放，利用毛细作用使溶液上渗。用Kimwipe纸或滤纸吸去多余液体后重复操作，注意避免产生气泡。
  14. 将载玻片置于塑料容器内湿润的纸巾上方，室温静置2小时。
  15. 将载玻片在Kimwipe/纸巾上沥干并分开，按步骤63所示放置于塑料容器底部。用BSA/Tris/NaCl/Triton溶液洗涤4次，每次15分钟，室温下轻柔振荡。
  16. 10 分钟，100 mM Tris（pH 9.5），100 mM NaCl，50 mM MgCl2 置于塑料容器底部，如第63步所述。
  17. Tris pH 9.5/NaCl/MgCl₂ 浸渍玻片2 溶液以确保完全洗去所有去垢剂。
  18. 制作三明治并吸取Western蓝溶液，步骤同65。重复一次。
  19. 将载玻片置于塑料容器中，容器内放置湿润的纸巾，并在完全黑暗条件下（用锡箔纸包裹）于室温放置1至5天。分别在6小时、12小时、24小时后检查，之后每天检查一次。
  20. 引流载玻片，用1x TE缓冲液冲洗以终止反应。在显微镜观察前加盖盖玻片。载玻片可保存在1x TE缓冲液中数月，但应尽快拍照记录。

配方/储备溶液

注意！尽可能使用无RNase的MilliQ水，例如经DEPC处理的MilliQ水（加入0.1% DEPC，静置过夜，然后在液体循环条件下高压灭菌（15 psi，即1.05 kg/cm2，20分钟）），或至少使用经过高压灭菌的MilliQ水。在配制缓冲液和储存液时，也可将无RNase的盐类等溶解于DEPC处理过的水中，而不必直接对缓冲液和储存液进行DEPC处理。如果不对水、缓冲液和储存液进行DEPC处理，则至少应进行高压灭菌或过滤除菌。
暂停！除非另有说明，缓冲液和储存液应于室温保存。
注意！许多缓冲液的配方及配制方法可参见《分子克隆实验指南》（Molecular Cloning（Sambrook, J., 和 D.W. Russell. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual. 第3版. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA））。

0.1 M 三乙醇胺（pH 8，体积：800 ml）中的乙酸酐。

成分体积/用量终浓度
三乙醇胺10.4 ml0.1 M 三乙醇胺
MilliQ水786.4 ml终体积 800 ml
HCl3.2 ml调至 pH 8.0
乙酸酐4.8 ml0.6%
  • 配制 0.1 M 三乙醇胺缓冲液（pH 8.0）：取 10.4 ml 三乙醇胺溶于 786.4 ml H2O 中，加入 3.2 ml 盐酸调节 pH 至 8.0（用 pH 指示剂检测）。
  • 将载玻片架用断裂的 10 ml 塑料移液管或类似物垫高，置于底部带有搅拌子的三乙醇胺容器中。
  • 在放入载玻片前几分钟，向三乙醇胺中加入 4.8 ml 乙酸酐，充分混匀。

注意：现配 0.1 M 三乙醇胺溶液，并在孵育前立即加入乙酸酐。
注意：使用玻璃容器。必须使用三乙醇胺缓冲液，因为乙酸酐在水中不稳定。

1% 琼脂糖凝胶（1 × TBE 缓冲液，体积：100 ml）

成分体积/用量终浓度
琼脂糖1 g1%
1 x TBE加至 100 ml

将琼脂糖与1 × TBE混合，加热至琼脂糖完全溶解。制备凝胶，并在1 × TBE缓冲液中进行电泳。

葡聚糖硫酸盐

将5 g硫酸葡聚糖用DEPC处理的MilliQ水定容至10 ml（即50% (w/v)），在60°C下溶解。
暂停！于-20°C保存。

0.5 M EDTA pH 8.0（三钠盐III，体积500 ml）

成分体积/用量终浓度
EDTA (372.24 g/mol)93.06 g0.5 M EDTA
MilliQ水加至 500 ml
NaOH约 10 g 颗粒调节 pH 至 8.0
DEPC0.5 ml0.1% DEPC

将EDTA溶于水中（在pH 8.0条件下溶解），加水定容至500 ml。加入0.1% DEPC，过夜放置。高压灭菌。

固定液（步骤 1-3，42）— 4% (w/v) 多聚甲醛溶于 1× PBS，pH 7.0（650 ml）

成分体积/用量终浓度
MilliQ水585 ml
10x PBS65 ml1x PBS
10M NaOH520 μl使pH值约为11
多聚甲醛26 g4%
浓盐酸449 μl使pH值约为7
  • 混合水、PBS 和 NaOH，加热至 +60–70°C（该温度和高 pH 有助于溶解多聚甲醛）。
  • 在通风橱中加入多聚甲醛。
  • 当溶液变澄清后，将其置于冰上，并通过加入 449 μl 浓盐酸将 pH 调至 7.0。

注意：需新鲜配制。
注意：在云杉实验方案中，戊二醛的终浓度为 0.25%，即在总体积为 650 ml 时加入 6.5 ml 的 25% 戊二醛，或在总体积为 1000 ml 时加入 10 ml 的 25% 戊二醛（注意应相应减少等体积的水）。
注意：在调节 pH 值后，加入少量吐温 20 和/或 Triton X-100，以降低表面张力，有助于完成第 1–3 步的固定。第 42 步中禁止使用！
注意：固定植物组织时，通常需要较小体积的固定液（例如 100–200 ml）。

10x 原位 盐溶液（体积 100 ml）

成分体积/用量终浓度
5 M NaCl60 ml3M NaCl
1 M Tris-Cl pH 8.010 ml0.100 M Tris
1 M Na Phosphate pH 6.810 ml0.100 M Na Phosphate
0.5 M EDTA10 ml0.050 M EDTA
MilliQ-水加至 100 ml

取 pH 6.8 的磷酸钠缓冲液（46.3 ml 1 M Na2HPO4 + 53.7 ml 1 M NaH2PO4）混合。加入 NaCl、Tris、磷酸钠缓冲液、EDTA 和水，混匀后高压灭菌。暂停！于 -20°C 保存。

4 M LiCl2（氯化锂，体积：100 ml）

成分体积/用量终浓度
LiCl2 (42.39 g/mol)16.956 g4M LiCl2
MilliQ水加至100 ml
DEPC0.1 ml0.1% DEPC

将LiCl2溶于水中，定容至100 ml。加入0.1% DEPC，过夜放置。高压灭菌。
暂停！于+4°C保存。

1 M MgCl2 · H2O（氯化镁，体积：100 ml）

成分体积/用量终浓度
MgCl2 · H2O (203.30 g/mol)20.33 g1 M MgCl2 · H2O
MilliQ水加至 100 ml
DEPC0.1 ml0.1% DEPC

将MgCl2溶于水中，定容至100 ml。加入0.1% DEPC，过夜放置。高压灭菌。
注意！MgCl2具有强吸湿性。开封后的试剂瓶不宜长期存放。

5 M NaCl（氯化钠，体积：1 l）

成分体积/用量终浓度
NaCl (58.44 g/mol)292.2 g5 M NaCl
MilliQ水加至1 L
DEPC1 ml0.1% DEPC

将NaCl溶于水中，定容至1 L。加入0.1% DEPC，过夜放置。高压灭菌。

1 M NaOAc pH 4.7（醋酸钠，体积：100 ml）

成分体积/用量终浓度
NaOAc (82.03 g/mol)0.8203 g1 M NaOAc
MilliQ水加至100 ml
乙酸调至pH 4.7
DEPC0.1 ml0.1% DEPC

将乙酸钠（NaOAc）溶于水中，调节pH至4.7，定容至100 ml，加入0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC），过夜放置，然后高压灭菌。

0.2 M Na2CO3 pH 11.4（碳酸钠，体积：10 ml）

成分体积/用量终浓度
Na2CO30.21198 g0.2 M Na2CO3 pH=11.4
MilliQ水加至10 ml

将Na2CO3溶于水中，定容至10 ml。pH值应为11.4。
注意！需新鲜配制。

0.2 M NaHCO3 pH 8.2（碳酸氢钠，体积：10 ml）

成分体积/用量终浓度
NaHCO30.16802 g0.2 M NaHCO3: pH=8.2
MilliQ水加至10 ml

将NaHCO3溶于水中；定容至10 ml。pH值应为8.2。
注意！现用现配。

1 M Na2HPO4 · 2 H2O（体积 500 ml）

成分体积/用量终浓度
Na2HPO4 · 2 H2O (177.99 g/mol)88.995 g1 M Na2HPO4
MilliQ水加至 500 ml
DEPC0.5 ml0.1% DEPC

将 Na2HPO4 溶于水中，定容至 500 ml。加入 0.1% DEPC，过夜放置。高压灭菌。

1 M NaH2PO2 · H2O（体积 500 ml）

成分体积/用量终浓度
NaH2PO4 · H2O (137.99 g/mol)68.995 g1 M NaH2PO4
MilliQ水加至 500 ml
DEPC0.5 ml0.1% DEPC

将NaH2PO4溶于水中，定容至500 ml。加入0.1% DEPC，过夜放置。高压灭菌。

5 倍 NTE（总体积：1 L）

成分体积/用量终浓度
5 M NaCl500 ml2.5 M NaCl
1 M Tris-Cl pH 825 ml50 mM Tris-Cl pH 8
0.5 M EDTA5 ml5 mM EDTA
MilliQ水470 ml终体积 1 L

混合 NaCl、Tris、EDTA 和水。不要进行 DEPC 处理。高压灭菌。

10 倍浓度 PBS（磷酸盐缓冲液），pH 7.0（总体积：1 L）

成分体积/用量终浓度
5 M NaCl260 ml1.3 M NaCl
1 M Na2HPO470 ml70 mM Na2HPO4
1 M NaH2PO430 ml30 mM NaH2PO4
MilliQ水640 ml终体积 1 L
DEPC1 ml0.1% DEPC

将 NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4 和水混合，用 HCl 调节 pH 至 7.0。加入 0.1% DEPC，过夜放置，然后进行高压灭菌。

20x SSC pH 7.0（总体积：1 L）

成分体积/用量终浓度
NaCl (58.44 g/mol)175.32 g3 M NaCl
Na Citrate (294.1 g/mol)88.23 g0.300 M Na Citrate
MilliQ水加至 1 L
HCl调至 pH 7.5
DEPC1 ml0.1% DEPC

将 NaCl 和 Na 柠檬酸盐溶解于约 800 ml 水中。用 HCl 调节 pH 至 7.0。加水定容至 1 L。加入 0.1% DEPC，过夜放置。高压灭菌。

5 × TBE（体积：1 L）

成分体积/用量终浓度
Tris (121.14 g/mol)54 g~ 0.45 M Tris
硼酸 (61.83 g/mol)27.5 g~ 0.45 M 硼酸
EDTA (372.24 g/mol)3.7 g~ 0.01 M EDTA
MilliQ水加至 1 L

混合 Tris、硼酸、EDTA 和水，pH 值应约为 8.3。使用前稀释至 1 × TBE。

10 × TE 缓冲液，pH 8.0（Tris EDTA，体积：1 L）

成分体积/用量终浓度
1 M Tris-Cl, pH 8.0100 ml0.100 M Tris-Cl
0.5 M EDTA pH8.0100 ml0.050 M EDTA
MilliQ-水加至 1 L

混合Tris、EDTA和水。不要用DEPC处理。高压灭菌。
注意！Tris不应进行DEPC处理！请使用无RNase的粉末，并用经DEPC处理或无RNase的MilliQ水稀释。

1 M Tris-HCl pH 7.5 - 9.5（体积 500 ml）

成分体积/用量终浓度
Tris (121.14 g/mol)60.57 g1 M Tris
MilliQ水加至500 ml
HCl调至pH 7.5
HCl调至pH 8.0
NaOH调至pH 9.5

将Tris溶解于经DEPC处理的水中。调节至所需pH值。加水定容至500 ml。高压灭菌。
注意！Tris不应进行DEPC处理！请使用无RNase的Tris粉末，并用经DEPC处理或无RNase的MilliQ水稀释。
注意！在《分子克隆》（见上文）中有一个表格，描述了为达到正确pH值所需加入的浓盐酸量。

材料与方法

原位 实验方案如上文及视频中所示。以下将介绍本示例中所用植物材料和探针的附加信息。

植物材料与实验设计

雄性球果来自 Picea abies [L.] Karst.（挪威云杉）于2007年秋季采自瑞典乌普萨拉。共切分8个球果，每个球果的切片均用于各处理组。测试了三种蛋白酶K浓度：1、3和 5 μg/μl 每个浓度均进行或不进行RNase处理。未进行RNase处理的载玻片在RNase处理期间置于PBS中。 拟南芥 [L.] Heynh. 和 Brassica napus L. 在培养室的受控条件下培养， 22°C/18°C 昼夜温度及16小时光周期。含有花蕾的幼嫩花序，花蕾发育阶段为0-10期（发育阶段依据Smyth） 5进行了研究。

cRNA 探针

总RNA从 P. abies 雄性球果，如先前所述6，以及 A. thaliana 和 B. napus 使用TRIzol（Gibco BRL，Frederick，Maryland，USA）和Qiagen RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen，Hilden，Germany）分别按照生产商推荐的方法提取总RNA。以0.5–1 μg 总RNA，根据物种而定，使用Superscript III Reverse Transcriptase（Invitrogen，Carlsbad，California，USA）按照制造商说明书进行逆转录。 AtAP3 和 BnAP3 正义链与反义链片段以及 P. abies 使用基因特异性引物（表1）分离并扩增了正义片段。 DAL13 使用引物对反义片段进行分离和扩增，引物同步骤7。在片段上添加T7悬垂 A. thaliana 和 P. abies 使用带有T7序列的修饰型反向引物（表1）扩增，获得一段500 bp的片段 BnAP3 特异性引物（表1）扩增后克隆至含有T7启动子的pGEM-T载体中。对于挪威云杉片段，所有PCR反应均在总体积为 20 μl 含0.2 U Phusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes，Espoo，芬兰）、1x Phusion HF缓冲液 200 μM 每种dNTP 0.3 μM 每种引物各使用相应量，cDNA 用量为 25–50 ng，并采用标准 PCR 程序，退火温度为 60–55°C （降落-1°C/循环）随后 55°C。针对这三种物种的正义和反义cRNA探针均通过以下方法合成 体外 使用 DIG RNA 标记试剂盒（SP6/T7；Roche Applied Science，Mannheim，德国）按照制造商推荐的方法进行转录，并用 Na 将长探针消化为约 100–150 bp 的片段2CO3 缓冲液，根据 3.

结果

在本结果部分，我们描述了三种典型的实验结果示例 原位 实验。

尽管裸子植物和被子植物这两个种子植物类群在2.85亿年前已经分化7-9，调控其生殖发育、决定雌雄器官身份的遗传机制似乎在进化上是保守的10。在A. thaliana中，花部同源异型基因APETALA3（AP311）和PISTILLATA（PI12）在花的结构背景下对雄性生殖器官发育具有必要且充分的作用，这一功能在被子植物谱系中似乎也是保守的13。在缺乏花朵、其生殖器官分别着生于独立的雄性和雌性球果中的裸子植物中（图1A-C），与AP3和PI同源的基因特异性地在雄球果的产粉器官——小孢子叶中表达7,14。因此，在被子植物和裸子植物中，相似的一组同源基因决定了产粉器官的身份。

分别针对AtAP3和BnAP3的基因特异性探针，在A. thaliana和B. napus幼嫩花芽的第3阶段，于对应花器官第二和第三轮的区域检测到信号。在更晚期的花芽中，信号局限于正在发育的花瓣和雄蕊（图2A和B）。这些结果与先前的研究一致11,15,16。针对P. abies中AP3同源基因DAL13的探针，在P. abies雄球果的微孢子叶中均检测到信号，无论是在顶端分生组织终止之前还是之后（图2C和D），这与先前研究的预期相符7,14。正义链探针未产生高于背景水平的信号（图3A-B及未显示数据）。综上所述，这些结果表明A. thaliana AP3及其在B. napus和P. abies中的直系同源基因在发育中的雄性生殖器官中表达。

花形态比较图；拟南芥、芸薹属和松属物种。

图1. A. thaliana 和 B. napus 的花及裸子植物 P. abies 产生花粉的雄性球果。图片A和B分别显示了A. thaliana和B. napus带有花蕾和开放花朵的花序。请注意，被子植物的花除了不育的花被外，还包含雄性和雌性生殖器官：雄蕊和心皮。图片C显示了裸子植物P. abies的枝条，其上具有绿色的营养针叶和红色的生殖雄性球果。

植物组织显微镜观察；用于研究分析的细胞结构和生长阶段示意图。

图2. A. thaliana AP3 基因及其在 B. napus 和 P. abies 中的同源基因的表达。显微图像显示了 A. thaliana 和 B. napus 的花序纵切面，分别如图 A 和 B 所示，以及 P. abies 雄球果的纵切面，如图 C 和 D 所示。使用针对 AtAP3 的反义探针杂交的切片（图 A）和针对 BnAP3 的反义探针杂交的切片（图 B）显示信号出现在花器官的第二轮和第三轮。数字表示根据Smyth5定义的花发育阶段。针对 DAL13 基因的反义探针在 P. abies 雄球果的产粉小孢子叶中产生信号，如图 C-D 所示。箭头指示小孢子叶的示例。图 A-D 中的箭头指示呈紫色的杂交信号。在图 C 和 D 中，酚类化合物使髓心中央个别细胞呈现褐色的非特异性着色。s，萼片；p，花瓣；st，雄蕊；c，心皮；ms，小孢子叶；pi，髓；pp，小孢子母细胞。比例尺：100 μm。

不同蛋白酶K条件下RNase作用效果的组织学切片比较，显微镜图像。

图3. DAL13 在挪威云杉（P. abies）雄球果中的表达。所有显微照片（A-H）均显示雄球果顶端分生组织终止后的纵切面。箭头指示DAL13表达的细胞类型。A和B中的切片使用正义对照探针进行杂交，以确定背景染色情况。C至H的显微照片使用DAL13反义探针进行杂交。D、F、H显示经RNase处理的实验切片，C、E、G显示未经RNase处理的实验切片。C和D显示使用1 μg/ml蛋白酶K处理的实验显微照片，E和F为3 μg/ml，G和H为5 μg/ml。比例尺：100 μm。

讨论

与 A. thaliana/B. napus 实验方案相比，P. abies 实验方案中的两个方面进行了优化：RNase 处理和蛋白酶 K 浓度。RNase 可去除背景信号，从而提高信号特异性17。蛋白酶 K 处理有助于组织通透，使探针能够进入并与目标 RNA 群体杂交。DAL13 反义探针在未经 RNase 处理的切片中显示出更强的信号（图 3C、E、G），而经 30 分钟 RNase 处理的切片信号较弱（图 2D、F 和 H）。由于 RNase 处理并未增强信号，因此在本方案中省略了该步骤。蛋白酶 K 处理测试了三种不同浓度：1、3 和 5 µg/ml。对于 P. abies，使用 1 µg/ml 蛋白酶 K 时观察到信号很弱或无信号（图 3C-D）；而使用 3 µg/ml（图 3E-F）和 5 µg/ml（图 3G-H）蛋白酶 K 时均获得了强信号。由于使用 5 µg/ml 蛋白酶 K 与使用 3 µg/ml 时的信号强度无明显差异，因此我们选择在方案中采用 3 µg/ml 的浓度。与 A. thaliana 和 B. napus 花芽相比，P. abies 雄球果需要更高浓度的蛋白酶 K，可能是由于其组织更为致密，且含有更高水平的酚类物质和多糖。

在固定和包埋过程中，A. thaliana/B. napus 实验方案与 P. abies 实验方案之间存在一些差异。需对目标组织进行固定以保留RNA，这是一个关键步骤，因为固定不良的材料即使含有高丰度的mRNA，也可能导致信号微弱或无法检测。组织需经过逐步脱水、透明和石蜡包埋，以避免组织损伤；在某些方案中，脱水所用的乙醇中会添加0.85% NaCl，以进一步防止细胞收缩或膨胀3。包埋过程中的脱水步骤可在冰上进行，以最大限度地降低RNase活性。在P. abies方案中，4%多聚甲醛固定液含有0.25%戊二醛，据称可更好地保留RNA17，尽管也有观点认为其可能并无显著差异3。切片后，将材料固定于载玻片上，并在杂交前进行预处理（即脱蜡、复水、通透化、降低探针非特异性结合的处理，最后再次脱水）。

本文所介绍的检测方案可在普通实验室中完成，信号通常在1至3天内出现，且信号与背景的比值可进行持续监测。与放射性标记探针相比，地高辛（DIG）标记探针通常产生更清晰的信号，稳定性更高，并可在连续实验中重复使用。然而，其灵敏度低于放射性探针17。原位杂交通过使用针对特定mRNA的标记探针来检测基因表达。放射性标记是一种稳定且灵敏的标记方法，但需要操作放射性物质，且结果的检测需耗时数周。而抗原标记探针则更稳定、更安全，且仅需数天即可完成检测介质的曝光17。因此，目前抗原标记方法占主导地位。无论采用何种实验方案，最关键的步骤均为探针设计。应确保探针具有高特异性，并使用高质量的UTP进行标记。有时需针对特定探针调整杂交温度和/或反应时间。

我们基于地高辛标记探针的改进方案将有助于同时在从拟南芥（A. thaliana）到挪威云杉（P. abies）等多种物种中定位mRNA表达，并经过少量调整后应可用于其他植物物种。该方案除雄性球果外，还已在挪威云杉（P. abies）的不同营养枝发育阶段以及合子胚和体细胞胚中进行测试，结果良好（未发表结果；Karlgren et al.）。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们非常感谢Anders Bovin为我们的影片提供了配乐，同时也感谢Michael Elliot Stocks自愿担任旁白配音。本研究得到了Carl Trygger基金会、瑞典农业大学农业功能基因组学战略研究计划（AgriFunGen）、瑞典研究理事会（VR）以及瑞典环境、农业科学和空间规划研究理事会（FORMAS）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酸酐Sigma-AldrichA6404-200ml最低纯度 98%
丙烯酰胺，线性Ambion9520
抗DIG抗体Roche Group
封闭试剂Roche Group11 175 041 910 或 11 096 176 001
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA7030-50g最低纯度 98%
去离子甲酰胺Sigma-Aldrich
Denhardt溶液Sigma-AldrichD2532-5ml
DEPC，焦碳酸二乙酯Sigma-Aldrich
硫酸葡聚糖Sigma-Aldrich
DIG RNA标记试剂盒（SP6/T7）Roche Group11175025910
戊二醛（25%）Histolab
糖原Ambion9510G
Histoclear IIHistolab包埋组织时可使用Tissue-clear、Histoclear II、二甲苯或类似替代物。
HistowaxHistolab包埋时可使用Histowax或Paraplast。
多聚甲醛Sigma-AldrichP6148-500g
Paraplast plusSigma-AldrichP3683-1kg包埋时可使用Histowax或Paraplast。
Phusion™ 高保真DNA聚合酶Finnzymes
Probe-on Plus载玻片Fisher Scientific22-230-900
蛋白酶KSigma-AldrichP2308-5mg
RNase ASigma-AldrichR5503-100mg
Tissue-clearSakura Finetek包埋组织时可使用Tissue-clear、Histoclear II、二甲苯或类似替代物。
三乙醇胺Sigma-AldrichT1377-100ml最低纯度 98%
Triton X-100使用实验室常规产品可选用Triton X-100和Tween-20中的一种或两种。
tRNASigma-Aldrich83853-100mg
Tween-20使用实验室常规产品可选用Triton X-100和Tween-20中的一种或两种。
Western BluePromega Corp.

参考文献

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