Shidham 法制备含 AV 标记物的细胞块，适用于含有散在单个细胞和小细胞团的细胞学标本。
本文内容
摘要
摘要
本视频演示了Shidham法，用于制备来自液基宫颈阴道细胞学标本的细胞块，这些标本含有散在的单个细胞和小细胞团。该技术采用HistoGel（Thermo Scientific）并结合常规实验室设备完成。
细胞块切片在非妇科细胞学评估中是一种有价值的辅助工具。它们使细胞病理学家能够研究更多的形态学标本细节，包括病变的组织结构。最重要的是，它们可用于进行辅助检测，例如免疫细胞化学、原位杂交检测（FISH/CISH）以及原位聚合酶链式反应（PCR）。传统的细胞块制备技术主要应用于非妇科细胞学标本，通常用于体液渗出物和细针穿刺活检样本。
基于液体的宫颈阴道标本的细胞含量通常低于非妇科来源的标本，常表现为大量分散的单个细胞。由于这一特点，要在细胞块切片中获得足够的细胞量较为困难。此外，制片的技术人员在切片时无法直观判断细胞浓度最高的所在层面，因此难以监控并选择合适的切片层面转移至玻片进行检测。结果可能导致含有目标细胞的细胞块区域被遗漏，要么切过头，要么切得不够深。目前 Shidham 方法的标准操作流程已针对上述问题进行了优化。尽管该方案最初是为妇科液体基细胞学标本制定并报道的，但也可应用于非妇科标本，如浆膜腔积液、细针穿刺样本、刷取物、囊肿内容物等，以提高细胞块切片中诊断性材料的质量。
方案
引言：
本视频介绍了Shidham法利用HistoGelTM（Thermo Scientific）（HG）从基于液体的细胞学（LBC）标本中制备细胞块的方法。与其他随机方法相比，本方案具有以下两个关键特点，适用于细胞含量相对较少、细胞呈单个散在分布的标本（1-5）。
- 本方案包含将细胞沿细胞包埋块切面平行平面进行集中的步骤。
- 还包括一个类似信标样的深色包含物（AV标记物，见图1b），其具有以下两个作用：
- 用于可视化显示细胞集中的层面。当切片过程中暴露出深色信标时，组织技术员即可识别出含有目标细胞的细胞包埋块区域。该监控能力可避免切穿细胞最集中的层面，或过度浅切至样本细胞浓度最高的层面。
- 作为不同载玻片上连续细胞包埋切片中的定位参考点。该参考点作为信标，有助于在采用SCIP方法（6,7）评估坐标免疫反应模式时，定位特定细胞或细胞群。
方案（图2）
样品制备。
- 将残留的LBC宫颈细胞学标本转移至平底玻璃管（15 mm直径 × 45 mm）中（见图2.1至2.4）。将玻璃管放入较大的塑料承载管（28 × 85 mm）中，进行离心。从承载管中取出玻璃底管，倾倒上清液。
- 随后将玻璃管加盖（以防止下一步加热过程中水溢出），并重新放回较大的平底塑料承载管中。
- 将装有玻璃管的塑料承载管加盖后放入离心机（需使用摆动吊篮式离心机，而非固定角度转子，以确保细胞垂直沉降到玻璃管的平底），在1805 G（3000 rpm，转子半径17 cm）条件下离心5分钟（见图2.5）。
- 离心结束后，垂直取出离心管，并用镊子将较小的玻璃管从较大的塑料承载管中取出，注意不要扰动已沉淀的细胞沉淀物。
- 打开玻璃管盖，小心倾倒上清液，避免扰动管底平坦的细胞沉淀层（见图2.6）。
加入参考坐标 AV 标记物并添加凝胶
- 将一个深色信标 AV-marker（约 2 mm × 2 mm 大小，表面平整，由深色可切片材料制成的小片）（图 3）作为标记物加入玻璃管中（图 2.7）。
- 取一份 HG 样品，用中等功率微波加热 10 秒使其熔化。
- 向管中加入 0.5 ml 熔融的 HG，迅速与沉淀物混合，并立即盖上盖子（图 2.8）（需迅速进行下一步操作，防止 HG 开始凝固）。
- 向载体塑料管中加入约 2.5 ml 温热（45°C）的水（图 2.9）。
- 将较小的带盖玻璃管垂直放入盛有温水的塑料管内（此步骤旨在防止 HG 在后续操作中过早凝固）（图 2.9）。
- 将装有玻璃管的塑料管置于离心机中（必须使用带摆动吊篮的离心机，而非固定角度转子，以确保细胞垂直沉降到玻璃管的平底端），在 1805 G（3000 转/分钟，转子半径 17 cm）条件下离心 5 分钟。该离心步骤的目的是推动 AV-marker，并将细胞浓缩至更靠近最终石蜡包埋细胞块切面的一侧（图 1d）。
- 随后小心地垂直取出离心后的管子，注意不要扰动底部已沉积的薄层细胞样本。
- 打开大号塑料管的盖子，用镊子垂直取出小号玻璃管，过程中避免扰动标本细胞的沉淀层。
- 将小号玻璃管垂直放入冰箱冷藏 15 分钟，使 HG 冷却并完全凝固（图 2.11）。
将含标本的凝胶块作为整体取出，进行最终处理
- 将10%甲醛通过注射器连接23号针头，从平底玻璃管底部注入，使凝固的HG圆盘及其底部的浓缩/沉淀样本层脱离管底（图2.12）。
- 将针头沿试管侧壁插入已凝固的含标本HG培养基圆盘边缘处（图2.12）。
- 将针头沿试管侧壁旋转，同时缓慢推动福尔马林溶液通过注射器。这会导致HG栓连同深色的AV标记物及其内部浓缩样本从玻璃试管的平底分离（图2.12）。
- 将细胞块（含标本细胞的凝胶小块）放入已标记的包埋盒中，送检 组织处理 制备石蜡包埋的细胞块（图 2.13）。
样品的包埋与切片
- 将圆盘的深色信标标记面朝下作为切割面，包埋于石蜡中（图1）。
- 切片至深色的 AV-标记物作为信标暴露并清晰可见为止。
- 从此层面切取3至4微米厚的切片，该层面应含有标本中大部分单个散在的细胞。
- 将切片收集到载玻片上，用于后续染色、免疫组织化学染色或其他指定检测。这些检测的具体方案（包括用于贴附切片的载玻片类型）可能有所不同。通常在免疫染色中使用涂层载玻片，以防止切片在免疫染色过程中从载玻片上脱落或漂浮丢失。
使用的缩写（按字母顺序排列）： CISH，染色原位杂交检测；FISH，荧光原位杂交检测；FFPE，甲醛固定石蜡包埋；FNA，细针穿刺；HG，HistoGel™（Thermo Scientific）；LBC，液基细胞学；PCR，聚合酶链式反应；
图1. 采用Shidham方案制备的细胞块结构。
图2. 采用Shidham方案从液基细胞学标本制备细胞块的不同步骤概要。
图3. 从香蕉皮制备AV标志物。
图4. 含AV标记物与不含AV标记物的细胞块及切片比较。
图5. 含AV标记物与不含AV标记物的细胞块切片细胞密度比较。
讨论
细胞块是评估各种细胞学标本的重要工具（1）。尤其重要的是，除了标本的组织结构特征外，细胞块还可用于进行免疫细胞化学、荧光/显色原位杂交检测（FISH/CISH）以及原位PCR等辅助研究。已有多种制备细胞块的方法被报道。然而，这些方法大多适用于含有相对较多细胞及组织微碎片的非妇科细胞学标本，例如细针穿刺抽吸物以及某些浆膜腔积液（如胸腹水）（1,3,4,5）。
由于细胞块主要为免疫细胞化学检测提供了机会，其处理方式应尽量与福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织相似。最终，细胞块切片免疫细胞化学检测的结果需要与主要基于FFPE组织切片发表的文献结果进行比较。任何对实验流程的改动都可能影响并削弱采用不同于常规FFPE所用固定剂和试剂流程处理的细胞块所得结果的有效性。某些商业技术可能存在缺陷，其流程涉及其他固定剂和试剂的处理步骤。
对于含有大量沉淀物和组织碎片的标本，可采用多种细胞块制备方法。主要原理是利用某种凝胶或凝固机制来支撑浓缩后的沉淀物。随后，经处理后的可操作小块组织可像外科病理标本或活检组织一样包埋于石蜡中。
所使用的凝胶包括明胶、琼脂、纤维蛋白原/血浆-凝血酶凝胶，以及其他商业凝胶如 HG。浓度的处理方法从通过离心简单沉淀浓缩细胞，到利用各种类型的膜对细胞进行浓缩不等。例如：Millipore 滤膜、火棉胶（Celloidin）袋，或从载玻片上的细胞学涂片上刮取细胞（1）。我们还通过尝试不同比例的琼脂与明胶组合评估了多种凝胶。然而，这些组合均未能达到足够坚固的一致性，无法从标本中完整地获得含有嵌入细胞的、易于操作的凝胶固化圆盘。HG 具有合适的一致性，根据我们的经验，其在 HG 细胞块切片上的免疫染色结果非常理想。
如上所述，用于宫颈阴道细胞学的基于液体的细胞学（LBC）标本通常比非妇科标本的细胞含量更少。此外，妇科LBC标本主要含有来自宫颈阴道黏膜的单个散在脱落的表层细胞。由于这一特点，若不采用特殊方法，可能难以在细胞块切片中获得足够的细胞量。由于组织技术员在切片过程中无法观察到细胞块中这些散在的细胞成分，因此难以判断细胞在切片中开始出现的层次，可能导致错过含有最多细胞的层次——要么切过了细胞最丰富的层次，要么未足够深入细胞浓度最高的层次（图4）。Shidham方案通过使用HG作为包埋介质以及常规实验室设备，解决了这两个问题（2）（图2）。
本方案包含以下两个主要特征（图1）：
- 将单个分散的细胞浓缩并排列在紧邻且平行于细胞包埋块切面的一个狭窄平面上（图5）。
- 加入类似信标样的深色AV-标记物作为指示标志。这对于实现以下特性至关重要：
- 识别并监测细胞在细胞包埋块中的浓缩层面。深色标志物的暴露提示了细胞包埋块中大多数单个分散细胞预期所在的位置（图4）。 这可防止对细胞包埋块进行过度切割（切过含有最多细胞的层面）或切割不足（未充分切入细胞浓度最高的层面），从而能够选择出细胞包埋块中细胞浓度最高层面的切片。
- 切片中的深色标志物还可作为参考点，用于在不同载玻片上细胞包埋块的连续切片中精确地定位和识别相同的细胞（图4）。在采用SCIP方法追踪特定细胞在不同切片中的坐标特性（如免疫表型）时，这一点至关重要（6,7）。
尽管我们的方案已标准化并针对液基宫颈细胞学标本进行了报告，但它也可用于提高许多其他非妇科标本的诊断检出率，例如浆膜腔积液、细针穿刺（FNA）、刷取物、囊肿内容物等。此外，AV标记物将有助于在对这些标本的细胞块切片进行免疫组织化学评估时更好地应用SCIP方法。包埋介质可根据相应步骤进行适当修改，替换为其他试剂。HG可用血浆（纤维蛋白原）替代，并在室温下通过凝血酶作用形成凝胶（1）。
致谢
作者感谢 Chris Chartrand（美国临床病理学会认证医学技术专家，HT(ASCP)）演示使用 AV 标记物对细胞块进行切片。
参考文献
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