可诱导的遗传谱系示踪（GIFM）可实现对细胞的精细时空控制下的标记与追踪 体内 并阐明特定遗传谱系的细胞如何贡献于发育中及成体组织。本文演示了对E12.5小鼠胚胎进行命运图谱绘制以开展表层荧光和外植体分析所需的技术。
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摘要
摘要
命运图谱通过在体内标记并追踪细胞，以确定前体细胞如何贡献于发育中及成体组织中的特定结构和细胞类型。Genetic Inducible Fate Mapping（GIFM，遗传诱导型命运图谱技术）是该概念的一项进展，可将基因表达、细胞命运和细胞行为在体内关联起来，从而基于遗传谱系构建命运图谱。
GIFM 利用 X-CreER 小鼠品系，其中 X 代表一个基因或一组基因调控元件，可驱动修饰的噬菌体蛋白——Cre 重组酶（CreERT）的空间特异性表达。CreERT 包含一个修饰的雌激素受体配体结合结构域，使得在无他莫昔芬药物存在时，CreERT 被滞留在细胞质中。他莫昔芬的结合可释放 CreERT，使其转位至细胞核，并介导位于 loxP 位点之间的 DNA 序列发生重组。在 GIFM 中，重组通常发生在 loxP 位点侧翼的终止盒（Stop cassette）与报告基因（如 GFP）之间。
小鼠经过培育，携带特定区域或特定细胞类型的CreER以及一种条件型报告等位基因。未经处理的小鼠不会产生标记，因为报告基因中的终止盒（Stop cassette）会阻止报告基因的进一步转录。我们通过灌胃法向定时妊娠的雌性小鼠给予他莫昔芬（tamoxifen），从而实现对CreERT活化的时间控制，使其随后转入细胞核，切除报告基因中的终止盒。在发生重组后，报告等位基因将被持续且可遗传地表达。这一系列事件使得细胞被永久标记，其遗传历史被不可逆地记录下来。因此，发生重组的报告基因可作为一种高保真的遗传谱系示踪工具，一旦启动表达，其信号即与最初驱动CreERT表达的基因表达状态无关。
我们在小鼠中应用基因诱导型谱系追踪技术（GIFM）来研究正常发育过程，并确定遗传谱系对成体细胞类型和组织的贡献。我们还利用GIFM追踪突变遗传背景下的细胞，以更深入地理解模拟人类遗传性疾病关键特征的复杂表型。
本视频文章指导研究人员成功应用基因诱导型荧光标记技术（GIFM）的实验方法。我们以特征明确的Wnt1-CreERT;mGFP小鼠为例，通过在胚胎第8.5天（E8.5）经口灌胃给予他莫昔芬，随后在胚胎第12.5天（E12.5）进行解剖，并利用落射荧光体视显微镜进行分析，展示该技术的操作流程。此外，我们还演示了如何对命运图谱标记的区域进行显微解剖，以制备外植体或用于流式细胞术（FACS）分析，并对成年期命运图谱标记的小鼠脑组织进行整体解剖，用于全组织荧光成像。综合而言，这些实验步骤使研究人员能够深入探究发育生物学及疾病模型中的关键科学问题。
方案
他莫昔芬的制备与灌胃操作（E8.5）
- 通过将他莫昔芬溶解于预热的玉米油中，配制20 mg/ml的他莫昔芬储备液。
- 将溶液置于37°C条件下，在旋转混合仪上孵育2小时，并间歇性涡旋混匀。
- 避光保存他莫昔芬储备液，置于4°C储存，可使用长达一个月。
- 进行谱系示踪实验时，建立交配组合：雌性为Swiss Webster品系（野生型；购自Taconic），雄性则同时携带一个基因特异性的CreERT等位基因和一个报告等位基因。为演示目的，本实验使用Wnt1-CreERT;mGFP雄性小鼠（Ellisor 2009）。
- 每天早晨检查Swiss Webster雌鼠是否出现阴道栓。发现阴道栓当天上午（0900）记为交配后0.5天，并以此为起点计算他莫昔芬给药时间。（本实验使用胚胎发育第8.5天）。
- 使用1 ml注射器连接动物喂食针头（20G x 1-1/2），吸取200 μl他莫昔芬储备液（含4 mg他莫昔芬）。
- 牢牢固定妊娠时间明确的Swiss Webster雌鼠，捏住其颈背部以固定头部，并将小鼠翻转至仰卧位。
- 用空闲的手指夹住尾巴，使身体保持直线状态。
- 将喂食针头从口角插入，并沿口腔顶部轻柔推进。
- 旋转针头使其与身体平行，同时向后倾斜头部以保持颈部伸直。
- 将针头沿食道向胃部推进。注意避免插入气管。若针头遇到阻力、动物出现咽反射或剧烈挣扎，应立即撤出针头并重新进行灌胃操作。
- 当喂食针头进入胃部后，将他莫昔芬注入胃内，随后将雌鼠放回原饲养笼，直至解剖日为止。
开颅手术：
- 用 4% 多聚甲醛对成年命运图谱小鼠进行心脏灌流，然后用剪刀在肩部上方切断脊柱，取下头部。
- 沿头部背侧中线（从头侧到尾侧）使用解剖刀切开头皮，暴露颅骨。
- 使用解剖刀刮除颅骨侧面和后部多余的组织或肌肉。
- 用镊子在嗅球前方中线处穿刺颅骨，制造一个小孔，以便插入精细剪刀的刀尖。
- 将精细剪刀插入小孔，从中线向两侧剪开，长度约与嗅球相当。该切口将在鼻骨与额骨交界处裂开颅骨，便于剪刀顺利进入。
- 沿颅骨的矢状缝（背侧中线）剪开，注意始终保持剪刀尖端向外倾斜，远离脑组织，以避免损伤下方组织。
- 用镊子轻轻夹住颅骨，沿中线切口向外剥离骨片以暴露脑组织。颅骨可能碎成小片或大块脱落。继续使用镊子去除所有额骨、顶骨、间顶骨和枕骨。
- 通过挤压位于小脑水平脑侧缘的副绒球周围骨性结构，将其周围的骨片压碎，然后轻轻移除这些骨片。
- 将头部倒置（背侧朝下），用镊子切断脑神经，使脑组织与颅骨分离。
整体装片显微技术：成年果蝇大脑
- 使用荧光解剖显微镜评估成年果蝇大脑中的GFP标记。
- 将大脑转移至含有PBS的培养皿中，并使用PictureFrame或其他合适软件进行拍照。
整体封片显微成像：E12.5 胚胎
- 使用荧光体视显微镜通过整体胚胎观察 GFP 标记情况。
- 将整体胚胎中显示 GFP 阳性的样本转移至含有 PBS 的培养皿中，并使用 PictureFrame 或其他适当软件进行拍照记录。
- 用镊子从每只胚胎上夹取一小段尾部组织，分别放入 PCR 管中，通过 PCR 方法（Ellisor 2009）对两个等位基因进行基因型鉴定，以确认整体胚胎分析所获得的结果。
E12.5 胚胎腹侧中脑的显微解剖与组织块制备
- 从子宫链中解剖出胚胎后，通过整体荧光标记确定命运图谱的胚胎，随后将胚胎转移至细胞培养皿中的冰上预冷的无菌 PBS 中。
- 使用精细剪刀，在菱脑节1（rhombomere 1）尾侧作横向切割，移除胚胎的头部部分。
- 接着，通过在间脑处进行冠状切口，移除头部的吻侧部分。此操作将暴露一个管状结构，其中第四脑室经中脑泡形成一条连接背侧与腹侧组织的通道。
- 小心地将剪刀尖插入第四脑室，沿背侧中线从尾侧向吻侧剪开，完全打开该管状结构，形成“开放式书本”制备样本。此时腹侧中脑将居中暴露，而中脑的两个背侧半部分则位于外侧。
- 清除腹侧中脑下方残留的非神经组织，使组织更平整地铺展。如有需要，可在吻侧和尾侧边缘做切口，使外植体的背侧“翼状”部分也能平展。此时外植体应形似一只“蝴蝶”，其中背侧中脑构成翅膀，菱脑节1构成尾部。
- 若需进一步分离腹侧中脑用于FACS分析或细胞培养实验，可去除组织的外侧（背侧部分）。
代表性结果：
在此GIFM实验中， Wnt1-表达细胞在胚胎发育过程中通过在E8.5时给予他莫昔芬而被永久且可遗传地标记 Wnt1-CreERT;mGFP 胚胎。随后，通过整体荧光观察和切片免疫组织化学对这些标记细胞进行可视化，以确定其发育过程中的变化规律 Wnt1衍生细胞在发育过程中对神经结构有贡献。整体荧光成像依赖于mGFP报告系统中膜结合的GFP组分，因此既能提供细胞水平的信息，也能呈现整体结构的概览 Wnt1-来源的神经投射。例如，在 E8.5 时期给予他莫昔芬处理， Wnt1-CreERTmGFP E12.5 胚胎在中脑、后部后脑和脊髓区域主要表现出 GFP 荧光（图 1A）。在高倍镜下，可见细小的神经元投射支配中脑、体壁、肢体以及颅面区域。在此发育阶段，胚胎呈半透明状，内部的 GFP 标记易于分辨。然而，随着脑组织的发育，成熟组织的密度会遮蔽来自脑内部结构的 GFP 荧光。因此，在 E8.5 时给予他莫昔芬，成年个体中仅能在上丘观察到微弱的 GFP 标记（图 1C，插图）。此外，可见部分轴突投射沿后脑腹侧表面走行（未显示）。相比之下，在 E9.5 给予他莫昔芬时，整个下丘均出现显著的 GFP 标记（图 1B，插图）。这种整体荧光强度的增加可能表明 Wnt1在E9.5时期表达的细胞对背侧中脑浅层区域的贡献较E8.5时期表达Wnt1的细胞更为显著，或在该区域内延伸出更多的突起。无论何种情况，整体荧光染色结果中所呈现的差异均反映了Wnt1在发育过程中表达的动态特性，并表明基因诱导谱系追踪技术（GIFM）可用于追踪从胚胎期到成体阶段不同细胞群体的发育轨迹。
通过免疫组织化学方法，在细胞水平上分析来自 Wnt1-CreERT;mGFP 动物的命运图谱组织切片。联合使用抗GFP和β-半乳糖苷酶（β-gal）抗体以及多种组织特异性生物标志物，以确定Wnt1谱系对神经结构和细胞类型的精细细胞贡献。在E8.5时期给予他莫昔芬处理，并于E12.5时期进行组织分析，可在中脑和后脑广泛观察到双阳性细胞（GFP+ 和 β-gal+），其投射通路贯穿腹侧中脑（图1B）。在成年脑中，E8.5时期标记的Wnt1谱系发育形成多个中脑结构，包括上丘和下丘，以及腹侧被盖区和黑质中多巴胺能细胞群附近的区域（图1D）（另见Zervas 2004）。相比之下，E9.5时期标记的Wnt1谱系则发育为下丘以及多巴胺能细胞群附近的神经元（图1F）。
图1. Wnt1-谱系示踪的代表性结果：
整体染色与免疫细胞化学实验结果示例 Wnt1-CreERT;mGFP 在E8.5（A-D）和E9.5（E-F）进行命运图谱标记（标记）的胚胎和成年大脑。A. Wnt1-CreER;mGFP E12.5 胚胎在中脑（Mb）、后部后脑（Hb）和脊髓（Sp）主要表现出 GFP 荧光。B. 通过免疫组织化学在细胞水平上观察和分析标记细胞，如本图所示的 1-μm 厚光学切片（40倍物镜，z轴序列采集）。细胞核β-半乳糖苷酶（nβ-gal）抗体标记（红色）与GFP抗体标记（绿色）显示命运图谱标记的细胞位于腹侧中脑。此处，重组细胞呈双阳性（nβ-gal+/GFP+），这是由条件性等位基因的特性所决定的 mGFP 报告基因。C. 整体荧光显微镜显示成年小鼠上丘（SC）中微弱的GFP荧光（插图）。评估 Wnt1 在成年切片中以低倍显微镜（5X）观察E8.5标记的谱系显示 Wnt1 谱系发育产生中脑结构，包括上丘（SC）和下丘（IC）的丘体（C）。D. 一张来自腹侧中脑多巴胺能神经元附近区域的40倍放大、1 mm光学切片，显示nβ-gal+细胞及丰富的GFP+轴突网状结构。E. 在E9.5进行标记后，可在中脑下丘通过整体荧光成像清晰观察到显著的GFP标记（插图）。 Wnt1 在成年切片中于 E9.5 标记的谱系（β-gal+，红色）集中分布于下丘（中脑背侧后部），低倍显微镜（5X）下可见（E）。F. 来自腹侧中脑多巴胺能神经元附近、厚度为 1 mm 的 40 倍光学切片，显示 nβ-gal+ 细胞及密集的 GFP+ 轴突网状结构Wnt1-在E8.5与E9.5标记的衍生神经元对背侧中脑的贡献逐渐受限，而 Wnt1 谱系持续参与腹侧中脑的发育。
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讨论
我们所展示的 GIFM 系统可用于回答多种细胞过程中广泛的问题。例如，可通过构建携带不同 Cre 驱动元件的小鼠，靶向任意特定的细胞类型、组织或遗传谱系。此外，由于他莫昔芬可在任何胚胎期或出生后时间点给予，因此可将重组事件控制在发育过程中的任意相关阶段。该系统的空间和时间控制特性，非常适用于研究表达特定基因的细胞如何参与特定结构或区域的形成，以及在发育过程中细胞迁移和模式形成事件。
除了通过免疫组织化学对细胞进行简单的标记和可视化（图1）外，GIFM技术还可用于多种应用。将GIFM与条件性基因敲除等位基因相结合，可实现对相关细胞群体的时空特异性基因功能缺失研究，同时利用报告等位基因对这些细胞进行标记。 Alternatively，从命运图谱动物中获取的组织可与荧光激活细胞分选（FACS）技术联合使用，从而将表达报告基因或特定标记物的细胞物理分离为不同的细胞群体。在胚胎发育过程中或从成年动物中分离的标记组织可进行体外培养，以便向特定谱系递送药物或遗传构建体。 体外.
我们的实验室利用GIFM研究获得的结果，...
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披露
所有作者对本工作的贡献均等，按姓氏字母顺序列出。每位作者的具体贡献可通过其在视频文章中的参与情况体现。
致谢
我们感谢 S. Arber 提供 mGFP 小鼠，感谢 Zervas 实验室成员对论文的审阅及提供的技术支持。A. Brown 获得了脑科学 Kaplan 暑期研究生研究奖的支持。E. Normand 获得了脑科学项目研究生研究奖的支持。本研究还得到了启动研究资金（MZ）的资助。
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参考文献
- Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system. Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).
- Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1. Neuron. 43, 345-357 (2004).
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