可诱导的遗传谱系示踪（GIFM）可实现对细胞的精细时空控制下的标记与追踪 体内 并阐明特定遗传谱系的细胞如何贡献于发育中及成体组织。本文演示了对E12.5小鼠胚胎进行命运图谱绘制以开展表层荧光和外植体分析所需的技术。
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摘要
摘要
命运图谱通过在体内标记并追踪细胞，以确定前体细胞如何贡献于发育中及成体组织中的特定结构和细胞类型。Genetic Inducible Fate Mapping（GIFM，遗传诱导型命运图谱技术）是该概念的一项进展，可将基因表达、细胞命运和细胞行为在体内关联起来，从而基于遗传谱系构建命运图谱。
GIFM 利用 X-CreER 小鼠品系，其中 X 代表一个基因或一组基因调控元件，可驱动修饰的噬菌体蛋白——Cre 重组酶（CreERT）的空间特异性表达。CreERT 包含一个修饰的雌激素受体配体结合结构域，使得在无他莫昔芬药物存在时，CreERT 被滞留在细胞质中。他莫昔芬的结合可释放 CreERT，使其转位至细胞核，并介导位于 loxP 位点之间的 DNA 序列发生重组。在 GIFM 中，重组通常发生在 loxP 位点侧翼的终止盒（Stop cassette）与报告基因（如 GFP）之间。
小鼠经过培育，携带特定区域或特定细胞类型的CreER以及一种条件型报告等位基因。未经处理的小鼠不会产生标记，因为报告基因中的终止盒（Stop cassette）会阻止报告基因的进一步转录。我们通过灌胃法向定时妊娠的雌性小鼠给予他莫昔芬（tamoxifen），从而实现对CreERT活化的时间控制，使其随后转入细胞核，切除报告基因中的终止盒。在发生重组后，报告等位基因将被持续且可遗传地表达。这一系列事件使得细胞被永久标记，其遗传历史被不可逆地记录下来。因此，发生重组的报告基因可作为一种高保真的遗传谱系示踪工具，一旦启动表达，其信号即与最初驱动CreERT表达的基因表达状态无关。
我们在小鼠中应用基因诱导型谱系追踪技术（GIFM）来研究正常发育过程，并确定遗传谱系对成体细胞类型和组织的贡献。我们还利用GIFM追踪突变遗传背景下的细胞，以更深入地理解模拟人类遗传性疾病关键特征的复杂表型。
本视频文章指导研究人员成功应用基因诱导型荧光标记技术（GIFM）的实验方法。我们以特征明确的Wnt1-CreERT;mGFP小鼠为例，通过在胚胎第8.5天（E8.5）经口灌胃给予他莫昔芬，随后在胚胎第12.5天（E12.5）进行解剖，并利用落射荧光体视显微镜进行分析，展示该技术的操作流程。此外，我们还演示了如何对命运图谱标记的区域进行显微解剖，以制备外植体或用于流式细胞术（FACS）分析，并对成年期命运图谱标记的小鼠脑组织进行整体解剖，用于全组织荧光成像。综合而言，这些实验步骤使研究人员能够深入探究发育生物学及疾病模型中的关键科学问题。
方案
他莫昔芬的制备与灌胃操作（E8.5）
- 通过将他莫昔芬溶解于预热的玉米油中，配制20 mg/ml的他莫昔芬储备液。
- 将溶液置于37°C条件下，在旋转混合仪上孵育2小时，并间歇性涡旋混匀。
- 避光保存他莫昔芬储备液，置于4°C储存，可使用长达一个月。
- 进行谱系示踪实验时，建立交配组合：雌性为Swiss Webster品系（野生型；购自Taconic），雄性则同时携带一个基因特异性的CreERT等位基因和一个报告等位基因。为演示目的，本实验使用Wnt1-CreERT;mGFP雄性小鼠（Ellisor 2009）。
- 每天早晨检查Swiss Webster雌鼠是否出现阴道栓。发现阴道栓当天上午（0900）记为交配后0.5天，并以此为起点计算他莫昔芬给药时间。（本实验使用胚胎发育第8.5天）。
- 使用1 ml注射器连接动物喂食针头（20G x 1-1/2），吸取200 μl他莫昔芬储备液（含4 mg他莫昔芬）。
- 牢牢固定妊娠时间明确的Swiss Webster雌鼠，捏住其颈背部以固定头部，并将小鼠翻转至仰卧位。
- 用空闲的手指夹住尾巴，使身体保持直线状态。
- 将喂食针头从口角插入，并沿....
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讨论
我们所展示的 GIFM 系统可用于回答多种细胞过程中广泛的问题。例如，可通过构建携带不同 Cre 驱动元件的小鼠，靶向任意特定的细胞类型、组织或遗传谱系。此外，由于他莫昔芬可在任何胚胎期或出生后时间点给予，因此可将重组事件控制在发育过程中的任意相关阶段。该系统的空间和时间控制特性，非常适用于研究表达特定基因的细胞如何参与特定结构或区域的形成，以及在发育过程中细胞迁移和模式形成事件。
除了通过免疫组织化学对细胞进行简单的标记和可视化（图1）外，GIFM技术还可用于多种应用。将GIFM与条件性基因敲除等位基因相结合，可实现对相关细胞群体的时空特异性基因功能缺失研究，同时利用报告等位基因对这些细胞进行标记。 Alternatively，从命运图谱动物中获取的组织可与荧光激活细胞分选（FACS）技术联合使用，从而将表达报告基因或特定标记物的细胞物理分离为不同的细胞群体。在胚胎发育过程中或从成年动物中分离的标记组织可进行体外培养，以便向特定谱系递送药物或遗传构建体。 体外.
我们的实验室利用GIFM研究获得的结果，.......
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披露
所有作者对本工作的贡献均等，按姓氏字母顺序列出。每位作者的具体贡献可通过其在视频文章中的参与情况体现。
致谢
我们感谢 S. Arber 提供 mGFP 小鼠，感谢 Zervas 实验室成员对论文的审阅及提供的技术支持。A. Brown 获得了脑科学 Kaplan 暑期研究生研究奖的支持。E. Normand 获得了脑科学项目研究生研究奖的支持。本研究还得到了启动研究资金（MZ）的资助。
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参考文献
- Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system. Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).
- Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L.
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重印与许可
