基于分裂泛素的膜酵母双杂交（MYTH）系统：鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的有力工具

摘要

MYTH技术能够灵敏地检测在模式生物酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中表达的蛋白质之间的瞬时和稳定相互作用。该方法已成功应用于研究外源性和酵母内在膜蛋白，以高通量方式鉴定其相互作用伙伴。

摘要

整合膜蛋白在生物学和临床上的重要意义推动了基于酵母的全长跨膜蛋白蛋白质相互作用（PPI）高通量鉴定系统的开发。为此，本实验室开发了基于分裂泛素的膜蛋白酵母双杂交（MYTH）系统。该技术能够灵敏地检测瞬时和稳定的蛋白质相互作用，利用Saccharomyces cerevisiae作为宿主生物体。MYTH 利用了这样一个观察结果：泛素可以被分割成两个稳定的片段，即酵母泛素的C端部分（C_ub) 和泛素部分的N端半段（N_ub). 在 MYTH 中，这一原理被改造用作蛋白质-蛋白质相互作用的“传感器”。简而言之，将整合膜蛋白作为诱饵与C端_ub与人工转录因子相连。猎物蛋白，无论是以单个形式还是文库形式，均融合至N端_ub部分。诱饵蛋白与猎物蛋白之间的相互作用会导致泛素片段重新构建成一个完整的“伪泛素”分子。该分子随后被细胞质中的去泛素化酶识别，从而导致转录因子被切割，并继而诱导报告基因的表达。该系统具有高度可适应性，特别适用于高通量筛选。该技术已成功应用于研究酵母及其他生物体中整合膜蛋白的相互作用。

方案

1. 背景信息

蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）是调控所有细胞过程的基本组成单元。因此，为了维持细胞稳态，必须对所有相互作用进行严格调控，因为这种生物平衡的改变通常在疾病和癌细胞转化中起重要作用。膜相关蛋白是最具生物学重要性的蛋白质类别之一，因为它们能够启动复杂的信号级联反应，并介导包括药物在内的多种分子的进出，在医疗领域具有重要意义，尤其是近年来与药物耐药性相关的问题日益普遍。深入了解这类蛋白质的复杂性需要鉴定其相互作用伙伴。然而，发现这些相互作用伙伴已被证明具有挑战性，因为通常需要针对每种膜结合蛋白优化苛刻的实验条件 [1]。

完整膜蛋白在生物学和临床上的根本重要性推动了基于酵母的高通量筛选系统的发展，用于鉴定全长跨膜蛋白的蛋白质相互作用（PPI）。为此，我们开发了基于分裂泛素的膜蛋白酵母双杂交（MYTH）系统[2-4]。该工具能够灵敏地检测瞬时和稳定的蛋白质相互作用，并已成功应用于研究在模式生物Saccharomyces cerevisiae中表达的外源性和内源性蛋白质[3-7]。MYTH系统利用了泛素可被分割为两个片段的特性：C端半分子（C_ub）和N端半分子（NubI）。体内研究表明，这两个片段由于彼此间具有高亲和力，能够自发地重新组装（图1a）。然而，在泛素的N端半分子中引入异亮氨酸13到甘氨酸的点突变（产生称为N

讨论

MYTH 是首个能够鉴定全长膜蛋白与胞质或膜结合伴侣蛋白之间相互作用的高通量系统。该系统已被用于研究来自多种生物体的膜蛋白[3-7]。然而，某些特定细节可能需要仔细评估，以确保目标蛋白适用于 MYTH 系统进行研究。

许多膜结合蛋白通过一段信号序列被定向至质膜，该信号序列随后被切除，从而产生成熟蛋白。这种信号序列具有物种特异性，因此当目标蛋白在酵母中表达时，其天然信号序列可能因无法被识别而导致蛋白错误定位。为解决这一问题，我们对这些特定蛋白进行改造，使其与来源于交配因子α（Mating factor alpha, MATα）的酵母信号序列融合。该肽序列（称为MFα-ss）可将蛋白重新定位至酵母质膜，并且重要的是，它能够被酵母信号肽酶切除。该肽序列存在于质粒pTMBV-MFα和pAMBV-MFα中。

另一个需要强调的重要参数是诱饵蛋白的表达水平。该参数由驱动诱饵蛋白表达的启动子所调控。可能需要利用NubG/NubI测试以及3-AT的使用浓度来优化诱饵蛋白的表达水平，以消除因过表达导致的假阳性信号，即诱饵蛋白“自激活”（例如，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚乙二醇（PEG3350）	BioShop Canada	PEG335
乙酸锂二水合物	BioShop Canada	LIA001
X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷）	BioShop Canada	XGA001
N,N-二甲基甲酰胺	BioShop Canada	DMF 451
3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）	BioShop Canada	ATT124
磷酸氢二钠	BioShop Canada	SPD307
磷酸二氢钠	Fisher Scientific	BP329-500
鲑鱼精DNA	VWR international	CA80601-120
D-葡萄糖	BioShop Canada	GLU501
LB肉汤LENOX	BioShop Canada	LBL405
酵母氮源基础	BioShop Canada	YNB406
酵母提取物	BioShop Canada	YEX401
蛋白胨	BD Biosciences	211677
生物蛋白胨	BioShop Canada	TRP402
硫酸腺嘌呤	BioShop Canada	ADS201
L-尿嘧啶	BioShop Canada	URA241
L-苏氨酸	BioShop Canada	THR002
L-组氨酸	BioShop Canada	HIS200
L-甲硫氨酸	BioShop Canada	MET222
L-缬氨酸	BioShop Canada	VAL201
L-苯丙氨酸	BioShop Canada	PHA302
L-异亮氨酸	BioShop Canada	ISO910
L-酪氨酸	BioShop Canada	TYR333
L-亮氨酸	BioShop Canada	LEU222
L-精氨酸	BioShop Canada	ARG006
L-色氨酸	Fisher Scientific	BP395-100
L-赖氨酸	BioShop Canada	LYS101
L-丙氨酸	Fisher Scientific	BP369-100
琼脂	BioShop Canada	AGR001
玻璃珠（Soda Lime Glass Beads）	Biospec Products	11079105
氯化钠	BioShop Canada	SLD002