不稳定多蛋白复合物的分离 体内 可控细胞交联与免疫磁珠亲和层析

摘要

细胞可渗透交联剂 DSP [二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)] 可稳定瞬时且不稳定的相互作用 体内，从而可利用严格的蛋白质复合物纯化技术进行分离。本文介绍一种对培养细胞进行交联后，通过免疫沉淀法分离蛋白质复合物的技术。

摘要

细胞机器的动态特性通常基于瞬时和/或弱相互作用的蛋白质关联。这些低亲和力的相互作用使得难以通过严格的方法来分离和鉴定目标蛋白质周围的蛋白质网络。使用化学交联剂可以选择性地稳定这些不稳定的相互作用，从而克服生化纯化中的限制。本文介绍了一种适用于培养细胞的实验方案，该方案使用一种具有12 Å间隔臂的同双功能交联剂——二硫代双（琥珀酰亚胺基丙酸酯）（DSP）。DSP分子中的二硫键可通过还原断裂。将交联与磁珠介导的免疫亲和层析相结合，可有效分离原本无法耐受纯化过程的蛋白质复合物。本方案与常规的蛋白质印迹（Western blot）技术兼容，并可扩展用于质谱分析进行蛋白质鉴定¹。

Stephanie A. Zlatic 和 Pearl V. Ryder 对本研究的贡献相同。

方案

1. 交联反应的准备工作

1. 需要接种足够数量的细胞，以确保每个标准管反应可获得 500 μg 蛋白质。对于通过免疫印迹鉴定目标蛋白的潜在互作蛋白，单个反应管可能已足够。在此情况下，可使用 SDS-PAGE 上样缓冲液洗脱磁珠结合的物质（免疫沉淀）。若进行质谱分析，则应将标准反应数量至少增加十倍，并使用抗体所识别的肽抗原进行竞争性洗脱（免疫亲和层析）。该策略可获得不含免疫球蛋白的蛋白复合物。
2. 交联的最佳细胞密度为 75% 至 90% 汇合度。在高汇合度条件下，细胞容易相互堆叠，从而降低细胞通透性交联剂对所有细胞的可及性。
3. 应在细胞培养板底部标注细胞类型和实验条件。我们常规设置仅含载体的对照组。
4. 除 DSP 溶液外，所有溶液均需在交联前配制完毕。
   1. 实验开始前，预先配制含 0.1 mM CaCl₂ 和 1 mM MgCl₂ 的磷酸盐缓冲液（PBS/Ca/Mg）。在实验过程中，钙离子和镁离子的添加对于维持细胞与培养板的黏附至关重要。4°C 保存。
   2. 50X 完全蛋白酶抑制剂混合液 —— 1 片溶解于 1 mL Milli-Q 水中。-20°C 保存。
   3. 20% Triton X-100：称取 10 g Triton X-100，用 Milli-Q 水定容至 50 mL。4°C 条件下轻轻摇动过夜，之后于 4°C 保存备用。保存时间不超过 1 个....

讨论

DSP 是一种膜通透性、化学可还原的交联剂，具有 12 Å 的间隔臂，可用于稳定瞬时蛋白质相互作用^1,2,3,4。本文以衔接蛋白复合物 AP-3 为例说明该策略，AP-3 是一种可溶性蛋白复合物，能够识别并将膜蛋白从早期内体分选至囊泡中⁵。AP-3 可选择性结合锌转运蛋白 ZnT3 和磷脂酰肌醇-4-激酶 II 型 α，但不结合转铁蛋白受体^1,4,6。我们进一步通过质谱技术将这些观察结果扩展至鉴定 AP-3 与膜蛋白及胞质因子之间的蛋白质相互作用网络¹。交联后采用低背景的免疫磁珠沉淀法来鉴定相互作用的蛋白质。此外，已有文献报道了可非特异性结合磁珠的蛋白质目录，可用于在质谱分析中初步排除非特异性蛋白的富集与鉴定⁷。DSP 利用胺反应性酯基团连接蛋白质中的伯胺，如赖氨酸残基或蛋白质的氨基末端。在变性条件下，DSP 分子可被裂解为两部分，仅在连接的氨基酸上留下较短的化学基团。对于某些抗原，在相同蛋白上样量条件下，DSP 处理细胞与 DMSO 对照组相比，免疫印迹检测的信号有所减弱（图1A）。这种减弱可能是由于 DSP 修饰后的赖氨酸导.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲盐水	Invitrogen	P4417	将1片溶于200 mL水中；加入MgCl2至终浓度1 mM，以及CaCl2至终浓度0.1 mM
二硫代双（琥珀酰亚胺基丙酸酯）（DSP）	Thermo Fisher Scientific, Inc.	22585	对湿气敏感，需储存于密封容器中，4°C保存
二甲基亚砜（DMSO）Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
曲拉通 X-100，SigmaUltra	Sigma-Aldrich	T9284
Dynabeads，羊抗小鼠IgG	Invitrogen	110.31	也可提供羊抗兔IgG磁珠
Dyna-Mag-2磁力架	Invitrogen	123-21D