细胞可渗透交联剂 DSP [二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)] 可稳定瞬时且不稳定的相互作用 体内，从而可利用严格的蛋白质复合物纯化技术进行分离。本文介绍一种对培养细胞进行交联后，通过免疫沉淀法分离蛋白质复合物的技术。
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摘要
摘要
细胞机器的动态特性通常基于瞬时和/或弱相互作用的蛋白质关联。这些低亲和力的相互作用使得难以通过严格的方法来分离和鉴定目标蛋白质周围的蛋白质网络。使用化学交联剂可以选择性地稳定这些不稳定的相互作用，从而克服生化纯化中的限制。本文介绍了一种适用于培养细胞的实验方案，该方案使用一种具有12 Å间隔臂的同双功能交联剂——二硫代双（琥珀酰亚胺基丙酸酯）（DSP）。DSP分子中的二硫键可通过还原断裂。将交联与磁珠介导的免疫亲和层析相结合，可有效分离原本无法耐受纯化过程的蛋白质复合物。本方案与常规的蛋白质印迹（Western blot）技术兼容，并可扩展用于质谱分析进行蛋白质鉴定1。
Stephanie A. Zlatic 和 Pearl V. Ryder 对本研究的贡献相同。
方案
1. 交联反应的准备工作
- 需要接种足够数量的细胞，以确保每个标准管反应可获得 500 μg 蛋白质。对于通过免疫印迹鉴定目标蛋白的潜在互作蛋白，单个反应管可能已足够。在此情况下，可使用 SDS-PAGE 上样缓冲液洗脱磁珠结合的物质（免疫沉淀）。若进行质谱分析，则应将标准反应数量至少增加十倍，并使用抗体所识别的肽抗原进行竞争性洗脱（免疫亲和层析）。该策略可获得不含免疫球蛋白的蛋白复合物。
- 交联的最佳细胞密度为 75% 至 90% 汇合度。在高汇合度条件下，细胞容易相互堆叠，从而降低细胞通透性交联剂对所有细胞的可及性。
- 应在细胞培养板底部标注细胞类型和实验条件。我们常规设置仅含载体的对照组。
- 除 DSP 溶液外，所有溶液均需在交联前配制完毕。
- 实验开始前，预先配制含 0.1 mM CaCl2 和 1 mM MgCl2 的磷酸盐缓冲液（PBS/Ca/Mg）。在实验过程中，钙离子和镁离子的添加对于维持细胞与培养板的黏附至关重要。4°C 保存。
- 50X 完全蛋白酶抑制剂混合液 —— 1 片溶解于 1 mL Milli-Q 水中。-20°C 保存。
- 20% Triton X-100：称取 10 g Triton X-100，用 Milli-Q 水定容至 50 mL。4°C 条件下轻轻摇动过夜，之后于 4°C 保存备用。保存时间不超过 1 个月。使用该 20% 储存液稀释配制下文所述的裂解缓冲液和免疫沉淀缓冲液。
- 50X DSP 终止液：1 M TRIS，调 pH 至 7.4。室温保存。
- 配制 10x Buffer A 溶液。
10X Buffer A：- 50 mL 1 M HEPES
- 150 mL 5 M NaCl
- 10 mL 0.5 M EGTA
- 250 μL 2 M MgCl2
- 调节 pH 至 7.4
- 定容至 500 mL
1x Buffer A 也用于裂解液和免疫磁珠沉淀缓冲液。
Buffer A 1X- 10 mM Hepes
- 150 mM NaCl
- 1 mM EGTA
- 0.1 mM MgCl2
- pH 7.4
- 裂解缓冲液：1X Buffer A + 0.5% Triton X-100。
- 免疫磁珠沉淀缓冲液（IP 缓冲液）：1X Buffer A + 0.1% Triton X-100。
2. 准备交联溶液
- 在用于细胞前立即配制 DSP 溶液。DSP 具有高度疏水性，应先溶于 DMSO，再稀释至 PBS/Ca/Mg 缓冲液中。将 40 mg DSP 溶解于 1 mL DMSO 中，配制成 100 mM 的 DSP 溶液（DSP 的分子量为 404.42 g/mol）。
- 将适量 PBS/Ca/Mg 缓冲液预热至 37°C，以促进 DSP/DMSO 溶液在 PBS 中的稀释。
不同培养皿规格所需体积如下：
6 孔板：每孔 2 mL
10 cm 培养皿：每皿 10 mL
15 cm 培养皿：每皿 20 mL - 每 1 mL 预热的 PBS/Ca/Mg 缓冲液中加入 10 μL DSP/DMSO 储存液。逐滴加入 DSP/DMSO 储存液，并不断混匀，直至 DSP 完全溶解。同时配制对照溶液：每 1 mL PBS/Ca/Mg 缓冲液中加入 10 μL DMSO。
- 将所有 PBS/Ca/Mg 溶液置于冰水浴中，放置时间不得超过 10 分钟。
3. 准备细胞用于交联
- 准备一个可容纳所有培养板的冰水浴，用于交联或对照溶剂孵育。
- 从37°C培养箱中取出培养板，并立即放入冰水浴中。
- 用预冷的含Ca²⁺/Mg²⁺ PBS洗涤细胞两次。每次使用的体积应与后续交联剂孵育时所用体积相同（见第2.2节）。
- 去除第二次洗涤液，加入对照溶剂或DSP交联缓冲液。
- 在冰上孵育两小时。建议每隔约二十分钟检查一次培养板，确保所有细胞均被溶液覆盖。您可能会观察到少量DSP从溶液中析出沉淀，此现象属正常情况。
4. DSP 反应的失活
- 配制1X DSP淬灭溶液：将20 mM Tris（pH 7.4）溶于PBS/Ca/Mg中（每1 mL PBS/Ca/Mg中加入20 μL 1 M Tris pH 7.4）。
- 移除对照溶剂和交联溶液。
- 加入预冷的失活溶液，冰上孵育15分钟。
5. 细胞裂解
- 在DSP淬灭孵育期间，配制含有Complete蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液：将0.5% Triton X-100溶于缓冲液A中，并为每1 mL裂解缓冲液加入20 μL的50X浓缩液。
- 完成15分钟的DSP淬灭孵育后，用PBS/Ca/Mg洗涤细胞两次。
- 向细胞中加入含Complete的裂解缓冲液，在4°C轻轻摇动30分钟。不同规格培养板建议使用的裂解缓冲液体积如下：
- 6孔板：每孔0.5 mL
- 10 cm培养皿：每皿1 mL
- 15 cm培养皿：每皿1 mL
- 裂解完成后，使用细胞刮刀将细胞从培养板上收集下来。务必保持裂解物置于冰上，以最大限度减少蛋白酶活性。
- 将细胞裂解物在台式小型离心机中于4°C以最大速度（15,000 × g）离心15分钟。
- 用移液器将上清液转移至新的离心管中，弃去沉淀。
- 检测蛋白浓度，并继续进行免疫沉淀实验。
6. 准备免疫磁珠沉淀
注意：此步骤通常在开始2小时交联孵育后直接进行。
- 取30 μL Dynal免疫磁珠、500 μL IP缓冲液（1×缓冲液A + 0.1% Triton X-100）以及适量的抗原特异性抗体，加入螺旋盖微量离心管中。设置不含抗体及非特异性抗体的对照管作为阴性对照。抗体的合适用量应根据各自抗原在单独实验中确定。标记所有IP管。
- 将IP管置于室温下，在翻转摇床（end-over-end rocker）上孵育2小时。或者，在交联前一天晚上于4°C下与抗体孵育过夜。
- 孵育结束后，短暂离心10秒，使磁珠聚集于管底。
- 将管子放入磁力架中，磁力架会将磁珠从管底吸附分离。当磁珠被安全固定后，即可轻松去除未结合的抗体。
- 使用小孔径的移液吸头（如加样枪头或P200吸头）移除孵育缓冲液及未结合的抗体。一旦移除孵育液体，立即加入1 mL IP缓冲液。
- 盖紧管盖，轻轻重悬磁珠，并将所有IP管在室温下以翻转方式旋转孵育5分钟。
- 用新鲜的1 mL IP缓冲液重复一次5分钟洗涤步骤（步骤6.3至6.6）。
- 在交联裂解液准备就绪并可加入磁珠前，IP管可保留在最后一次洗涤的孵育状态中。
7. 将交联裂解液与免疫磁珠孵育
- 最后一次洗涤后，将免疫磁珠在小型离心机中离心10秒。随后将离心管插入磁力架中。
- 再次使用细孔径吸头，从离心管中移除孵育液。立即向含有免疫磁珠的离心管中加入500 μL交联的细胞裂解液（假设裂解液浓度为1 μg/mL）。如果使用肽竞争作为阴性对照，此时应加入适量的肽。应通过前期实验确定合适的肽竞争条件。或者，您也可以设置不含裂解液的免疫磁珠作为阴性对照。在此情况下，立即向免疫磁珠中加入500 μL裂解缓冲液（1x Buffer A + 0.5% Triton X-100）并加入Complete蛋白酶抑制剂。
- 轻轻重悬磁珠。将重悬后的磁珠在4°C下以翻转混匀的方式孵育2小时。
8. 洗去未结合的裂解液成分
- 裂解液完成充分孵育后，在小型离心机中快速离心10秒。随后将离心管放入磁力架中。实验剩余步骤中，磁力架应始终保持在冰浴中。
- 使用细孔径的移液吸头，移除所有未结合的裂解液。在完全移除未结合裂解液后，立即加入1 mL IP缓冲液。
- 盖上管盖，轻轻重悬磁珠。
- 待磁珠完全重悬后，重复磁珠沉淀步骤（8.1）。
- 再次吸除全部孵育液体，并立即加入1 mL IP缓冲液，然后盖上管盖。
- 在IP缓冲液中轻轻重悬磁珠，于4°C条件下以翻转摇动方式孵育5分钟。
- 重复磁珠洗涤步骤（8.4至8.6）再进行4次。
9. 变性样品并从磁珠中收集
- 完成所有免疫磁珠沉淀管的洗涤后，重新沉淀磁珠（8.1），并将试管放入磁力架中。
- 在变性条件下洗脱结合到免疫磁珠上的蛋白质。吸除最后一次IP缓冲液洗涤液，并将IP管从磁力架上取下。
- 向IP管中加入1×上样缓冲液，液面略高于磁珠沉淀，以使磁珠重新聚集于管底。上样缓冲液的用量取决于所用凝胶的加样孔大小。可能需要轻轻敲击管底，使所有磁珠充分重悬于上样缓冲液中。
- 对每个IP管重复变性步骤（9.2 至 9.3）。
- 将重悬于上样缓冲液中的免疫磁珠在75°C加热5分钟，以完成变性过程。
- 样品变性后，可直接上样于SDS-PAGE凝胶进行Western blot检测。空的免疫磁珠可通过离心重新沉淀，并用磁力架从样品中去除。
10. 使用抗原肽洗脱交联复合物（免疫亲和层析）。
- 完成所有免疫磁珠免疫沉淀管的洗涤后，重新沉淀磁珠（8.1），并将离心管放入磁力架中。吸除上清液，加入10 μl含有抗原肽的缓冲液A，该抗原肽可被用于蛋白复合物免疫分离的抗体所识别。应测试10–200 μM范围内的不同浓度，以实现有效的洗脱。
- 在4°C下孵育磁珠2小时。
- 将磁珠置于磁力架上，小心回收10 μl洗脱产物。保留此上清液。
- 用缓冲液A快速洗涤磁珠，弃去洗涤液。保留磁珠。
- 向保留的上清液和磁珠中加入上样缓冲液，使其终浓度为1×。将这些离心管在75°C孵育5分钟。
- 通过SDS-PAGE分析磁珠和肽段洗脱液。通过SDS-PAGE蛋白染色或免疫印迹检测，洗脱液应无IgG污染（图1B）。该无IgG的样品适用于质谱分析。
图 1. AP-3 相互作用蛋白复合物及膜蛋白的分离。 HEK293 细胞（A）或 PC12 细胞（B）分别用载体对照（DMSO，图 1A 中奇数泳道）或 DSP（图 1A 中偶数泳道，或图 1B 所有泳道）处理。澄清的提取物分别与仅珠粒（图 1A，泳道 3–4）、转铁蛋白受体抗体（图 1A，泳道 5–6）或 AP-3 δ 抗体（图 1A，泳道 7–10；图 1B，泳道 1–10）孵育。免疫复合物用 SDS-PAGE 上样缓冲液（图 1A）、仅 Buffer A（图 1B，泳道 1–2）或添加了递增浓度的人源 δ-衔接蛋白氨基酸 680–710 对应的 δ 抗原肽的 Buffer A（NCBI:AAD03777；gi:1923266）（图 1B，泳道 3–10）洗脱。该肽可结合 δ 抗体。肽洗脱后，上清液（S）和珠粒（B）通过免疫印迹进行分析（图 1B）。通过针对 δ、β3 和 σ3 亚基的抗体检测到的 AP-3 与以下可溶性因子共沉淀：网格蛋白重链（CHC）、BLOC-1 亚基 pallidin 和 HOPS 复合物亚基 vps33b；同时也与膜蛋白磷脂酰肌醇-4-激酶 II 型 α（PI4KIIα）和锌转运蛋白 3（ZnT3）共沉淀。注意图 1B 中肽洗脱上清液中不存在小鼠 IgG 重链。
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讨论
DSP 是一种膜通透性、化学可还原的交联剂，具有 12 Å 的间隔臂，可用于稳定瞬时蛋白质相互作用1,2,3,4。本文以衔接蛋白复合物 AP-3 为例说明该策略，AP-3 是一种可溶性蛋白复合物，能够识别并将膜蛋白从早期内体分选至囊泡中5。AP-3 可选择性结合锌转运蛋白 ZnT3 和磷脂酰肌醇-4-激酶 II 型 α，但不结合转铁蛋白受体1,4,6。我们进一步通过质谱技术将这些观察结果扩展至鉴定 AP-3 与膜蛋白及胞质因子之间的蛋白质相互作用网络1。交联后采用低背景的免疫磁珠沉淀法来鉴定相互作用的蛋白质。此外，已有文献报道了可非特异性结合磁珠的蛋白质目录，可用于在质谱分析中初步排除非特异性蛋白的富集与鉴定7。DSP 利用胺反应性酯基团连接蛋白质中的伯胺，如赖氨酸残基或蛋白质的氨基末端。在变性条件下，DSP 分子可被裂解为两部分，仅在连接的氨基酸上留下较短的化学基团。对于某些抗原，在相同蛋白上样量条件下，DSP 处理细胞与 DMSO 对照组相比，免疫印迹检测的信号有所减弱（图1A）。这种减弱可能是由于 DSP 修饰后的赖氨酸导...
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致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院向 V.F. 提供的资助（NS42599 和 GM077569）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 磷酸盐缓冲盐水 | Invitrogen | P4417 | 将1片溶于200 mL水中；加入MgCl2至终浓度1 mM，以及CaCl2至终浓度0.1 mM |
| 二硫代双（琥珀酰亚胺基丙酸酯）（DSP） | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22585 | 对湿气敏感，需储存于密封容器中，4°C保存 |
| 二甲基亚砜（DMSO）Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| 曲拉通 X-100，SigmaUltra | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Dynabeads，羊抗小鼠IgG | Invitrogen | 110.31 | 也可提供羊抗兔IgG磁珠 |
| Dyna-Mag-2磁力架 | Invitrogen | 123-21D |
参考文献
- Salazar, G. Hermansky-Pudlak syndrome protein complexes associate with phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha in neuronal and non-neuronal cells. J Biol Chem. 284, 1790-1802 (2009).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate. J Mol Biol. 104, 243-261 (1976).
- Xiang, C. C. Using DSP, a reversible cross-linker, to fix tissue sections for immunostaining, microdissection and expression profiling. Nucleic Acids Res. 32, e185-e185 (2004).
- Craige, B., Salazar, G., Faundez, V. Phosphatidylinositol-4-Kinase Type II Alpha Contains an AP-3 Sorting Motif and a Kinase Domain that are both Required for Endosome Traffic. Mol Biol Cell. 19, 1415-1426 (2008).
- Newell-Litwa, K., Seong, E., Burmeister, M., Faundez, V. Neuronal and non-neuronal functions of the AP-3 sorting machinery. J Cell Sci. 120, 531-541 (2007).
- Salazar, G. The Zinc Transporter ZnT3 interacts with AP-3 and it is Targeted to a Distinct Synaptic Vesicle Subpopulation. Mol Biol Cell. 15, 575-587 (2004).
- Trinkle-Mulcahy, L. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
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