由不稳定的多蛋白质复合物的分离在体内控制细胞的交联和免疫磁性亲和层析

摘要

细胞透水交联剂DSP [dithiobis（琥珀酰亚胺丙酸）]稳定短暂和不稳定的相互作用在体内，这使得他们的隔离，使用严格的蛋白质复合体的净化技术。在这里，我们目前培养的交联，由免疫蛋白复合物的分离细胞的技术。

摘要

蜂窝机械的动态性质经常是建立在瞬态和/或弱蛋白协会。这些低亲和力相互作用排除围绕一个感兴趣的蛋白质，蛋白质网络的隔离和识别的严格方法。使用化学交联剂允许的不稳定相互作用的选择性稳定，从而绕过生化净化的局限性。在这里，我们提出在文化协议细胞适合使用一个homobifunctional交联剂间隔臂12埃，dithiobis（琥珀proprionate）（DSP）。 DSP是一个分子中的二硫键还原裂解。交联与磁珠的利益的蛋白质与免疫层析相结合，使蛋白质复合物，否则将不能承受净化隔离。此协议是与常规免疫印迹技术兼容，它可以扩展为蛋白质鉴定的质谱^1。

斯蒂芬妮A. Zlatic和珠江五莱德贡献同样对这项工作。

方案

1。准备交联

1. 您将需要板足够数量的细胞，让500微克每标准管反应蛋白的隔离。单管可能足以确定一个由免疫印迹的兴趣的蛋白质公认interactors。在这种情况下，珠约束的材料可以用SDS - PAGE样品缓冲液（免疫）洗脱。标准反应质谱分析，应增加至少十倍，应使用的抗体（免疫亲和层析）认可的一种肽类抗原竞争洗脱的蛋白质复合物。这一战略将让免疫球蛋白的蛋白质复合物的隔离。
2. 交联的最佳细胞密度是75％至90％汇合。在高汇合条件下，细胞往往桩上对方，从而降低所有细胞的细胞渗透交联剂的无障碍。
3. 细胞类型和实验条件下，应标示单元板的底部。我们通常包括仅与车辆控制。
4. 除了DSP解决方案，以交联前的所有准备解决方案。
   1. 氯化钙₂ 0.1毫米和氯化钙₂ 1毫米（PBS / CA /镁）开始实验前准备的磷酸盐缓冲液缓冲库存。除了钙，镁离子是细胞在实验过程中培养板的附着力的关键。保存在4 ° C。
   2. 50X完整的蛋白酶抑制剂 - 1ML Milli - Q水溶解1片。储存在-20 ° C。
   3. 20％的Triton X - 100的重量了10G TRITON X -100和稀释在50毫升Milli - Q水的总量。岩石在4 ° C过夜，并储存于4 ° C直到使用。不要存放超过1个月。使用这20％的股份稀释，以准备下面描述的缓冲区的裂解和IP。
   4. 50X DSP淬火液1M....

讨论

DSP，膜渗透，化学还原与12 Å间隔臂的交联剂是用来稳定瞬态蛋白质^相互作用 1,2,3,4 。在这里，我们体现这一战略与AP - 3适配器复杂的一种可溶性蛋白复合物，囊泡膜蛋白识别和排序，从内涵^体 5 。 AP - 3的选择性结合的锌转运ZnT3和脂质激酶磷酸肌醇4激酶II型阿尔法但不转铁蛋白^受体 1,4,6 。我们扩大了这些意见，以确定^质谱 1膜蛋白和胞质因素AP - 3蛋白的相互作用网络。低背景免疫磁性降水量如下，以确定相互作用的蛋白质的交联。此外，非选择性磁珠的蛋白质结合的出版目录，允许一个非特定的蛋白质的分离和鉴定^的第一关，消除质谱7。 DSP采用胺反应的酯基，伯胺，如赖氨酸或蛋白质的氨基酸总站链接。变性条件后，DSP分子裂解一半，留下联系在一起的氨基酸短的化学基团。对于某些抗原有免疫印迹在免疫信号减少二甲基亚砜控制和DSP处理的细胞（Figure1A）之间比较平等的蛋白质负荷时。这是可能的，在DSP的抗体的亲和力下降，下降的结果修改赖氨酸。除了这些罕见的情况下，使用DSP的化学交联，提高了检测能力密切相互作用的膜相.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲盐水	Invitrogen	P4417	将 1 片溶解在 200 mL 水中;加入 MgCl2 至终浓度为 1 mM 和 CaCl2 至终浓度为 0.1 mM
Dithiobis（琥珀酰亚胺丙酸酯）（DSP）	Thermo Fisher Scientific， Inc.	22585	湿敏性，储存在密封容器中 4°C
二甲基亚砜 （DMSO） Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
Triton X-100、SigmaUltra	Sigma-Aldrich	T9284
Dynabeads、绵羊抗小鼠 IgG	Invitrogen	110.31	磁珠也可用作绵羊抗兔
Dyna-Mag-2 磁力架	Invitrogen	123-21D