我们描述了一种分析糖蛋白在哺乳动物细胞中生物合成后早期生命周期内N-连接聚糖变化的方法。该方法通过代谢标记聚糖的脉冲-追踪分析、从糖蛋白上酶法释放聚糖，并利用高效液相色谱（HPLC）进行检测。
本文内容
摘要
摘要
Glc的连接3男性9GlcNAc2将前体寡糖链转移到内质网中新生多肽链上是分泌蛋白常见的修饰方式。尽管该修饰已知参与多种生物学过程，但其功能的其他方面也正在被揭示，最近的研究证据表明其在糖蛋白质量控制和转运信号产生中具有重要作用。因此，与N-连接聚糖及其加工相关的现象正受到深入研究。近年来开发的蛋白质组学分析方法已显著改善了对糖蛋白N-连接聚糖的表征。然而，这些方法无法揭示糖链加工过程的动力学信息。为此，通常采用标记和脉冲-追踪分析技术，但这些方法往往复杂且产量极低。本文介绍一种简单的方法，用于分离和分析代谢标记的N-连接寡糖链。该方案基于使用[2-3H]甘露糖，通过使用endo H和N-糖苷酶F依次处理，从特异性免疫沉淀的目标蛋白或总体糖蛋白池中，在变性裂解条件下释放寡糖，随后通过分子滤过（Amicon）进行纯化。在此方法中，分离得到的寡糖可作为HPLC分析的输入样品，从而可根据组成寡糖的单糖单元数量区分不同的糖链结构，分辨率达到单个单糖水平。利用该方法，我们能够在正常条件及蛋白酶体抑制条件下，研究脉冲-追踪实验后全细胞糖蛋白的高甘露糖型N-连接寡糖谱型。这些谱型还与从免疫沉淀获得的内质网相关降解（ERAD）底物中得到的谱型进行了比较。我们的结果表明，大多数NIH 3T3细胞的糖蛋白相对稳定，其大部分寡糖被修剪为Man9-8GlcNAc2. 相比之下，不稳定的ERAD底物被修剪为Man6-5GlcNAc2且当蛋白酶体降解受到抑制时，携带这些物种的糖蛋白会积聚。
方案
以下方案适用于分析总糖蛋白或特定目标糖蛋白的糖链。两种情况的基本步骤相同，仅在本方案所述的若干细节上有所调整。
- 用于N-连接聚糖的代谢标记时，每个样本（样本可代表不同的时间点或处理条件）需要使用在90 mm培养皿中过夜培养的亚融合状态哺乳动物细胞。本方案已针对NIH 3T3细胞优化。
- 通过在5 ml新配制的预热（37°C）无葡萄糖培养基中孵育，使细胞处于无葡萄糖环境，培养基中添加10%透析胎牛血清和4 mM丙酮酸钠，孵育时间为5-15分钟。
- 更换为 1 ml 预热（37°C）的无葡萄糖培养基，其中含有 400 μCi 的 [2-3[³H]-标记的甘露糖（标记总糖蛋白时使用较低浓度，为65 μCi/ml），在正常组织培养条件下孵育细胞1小时。
- 从每个样本中移除标记培养基，向对应脉冲（pulse）的样本小心加入 2 ml 4°C 的 PBS，并置于冰上（这些样本称为脉冲样本）；而对应追踪（chase）的样本需用 2 ml 预热至 37°C 的正常完全培养基洗涤 3 次，然后置于 CO₂ 培养箱中继续培养。2 在37°C培养箱中，加入5 ml预热的常规培养基，孵育所需的时间以进行追踪实验。
- 将脉冲样品（先前置于冰上）用2 ml预冷的PBS洗涤3次。然后用细胞刮匙在2 ml PBS中将细胞从培养皿上刮下，并转移至2 ml离心管中。
- 以16000×g短时离心（6–10秒），弃上清，将细胞沉淀在-80°C下冷冻保存。
- 在 chase 时间结束时，对 chase 样本同样执行步骤 5 和 6。
- 从冻存管中取出细胞，加入300 μl缓冲液A，短暂涡旋混匀后冰上孵育20分钟；若进行总糖蛋白分析，则使用缓冲液B在冰上孵育20分钟，随后进行超声处理（4次，每次10秒，最大振幅），最后将样品煮沸5分钟。
- 在4°C条件下，以16000×g离心裂解液20分钟。将上清液转移至新的Eppendorf管中，弃去沉淀。
- 若分析总糖蛋白，则进入分子过滤和去糖基化步骤（步骤17）。若需对本实验所示的H2a糖蛋白进行免疫沉淀，则向步骤9所得上清液中每样品加入20 μl（Repligen）蛋白A-agarose beads 1:1悬浮液，以及3 μl/样品的兔多克隆抗H2a抗体（针对目标糖蛋白，本例为抗H2a抗体）。
- 将样品在 4°C 条件下孵育 4–16 小时，并通过缓慢旋转持续混匀。
- 在16000×g离心30秒使磁珠沉淀，小心用真空吸除上清液。
- 加入500 μl缓冲液D，涡旋振荡洗涤磁珠。按步骤12离心后弃去上清液。重复洗涤3次。
- 向珠粒沉淀中加入10 μl变性缓冲液（随NEB内切糖苷酶H试剂盒提供），并将样品煮沸5分钟（当分析总蛋白时，去糖基化步骤在Microcon滤膜上进行，见步骤17）。
- 离心珠子（16000×g，30秒），将上清液转移至新的Eppendorf管中。随后向每个样品中加入0.5 μl内切糖苷酶H（endo H）以及10 μl反应缓冲液（随NEB内切糖苷酶H试剂盒提供），于37°C孵育3小时。
- 为将释放的糖链与蛋白质分离，将样品用去离子水稀释5倍后，置于截留分子量为30 kDa的分子滤膜（Microcon Ultracel YM30）上，于14000×g离心3分钟。加入50 μl去离子水，重复离心。此洗涤步骤再重复2次，每次均保留滤过液。
- 如果分析总糖蛋白，将裂解液的上清液（来自步骤9）加入Microcon滤膜。用100 μl缓冲液E重复离心洗涤3次，每次14000×g离心3 min。向Microcon滤膜截留物中加入3 μl 10×内切糖苷酶H反应缓冲液和1.5 μl内切糖苷酶H酶，37°C孵育3小时。释放的糖链通过去离子水重复离心3次（如步骤16所述）洗脱。
- 如有需要，将步骤16和17中的截留物（含有内切糖苷酶H抗性糖蛋白）与200 mU的N-糖苷酶F在15 μl缓冲液C中于37°C孵育16小时。随后按步骤16方法用去离子水洗脱。
- 将含有内切糖苷酶H反应穿流液的离心管（步骤16和17）置于真空浓缩仪中，彻底干燥样品（可设置温度不超过45°C以加速该过程）。
- 为进行高效液相色谱分析，将干燥的沉淀物重新悬浮于12 μl HPLC溶剂（乙腈:水, 60:40, 含1%磷酸）中。
- 将高效液相色谱仪（连接Spherisorb色谱柱）调节至溶剂流速恒定（1 ml/min）和压力恒定（1000至2000 psi之间的某一特定值），并放置馏分收集器，每1分钟更换一次收集管。
- 将样品注入高效液相色谱仪，并同时启动组分收集器。
- 从每次样品运行以及标准寡糖混合物的运行中，各收集 48 个 1 ml 的组分。
- 将每份500 μl转移至闪烁瓶中，并与3 ml可与水混溶的闪烁液混合。
- 将小瓶上机，并用液体闪烁计数器读数。
- 将每分钟计数（cpm）读数对组分数作图。
- 峰内的每分钟计数（cpm）值代表特定的糖链种类：第18-21组分对应M5，第22-26组分对应M6，第27-31组分对应M7，第32-35组分对应M8，第36-39组分对应M9，第40-42组分对应G1M9，第43-45组分对应G2M9。
- 每个峰内各组分的cpm值总和反映了特定糖链种类的绝对量。为了校正含有较多甘露糖残基的糖链会结合更多标记物这一因素，每种糖链种类的“相对摩尔量”按如下方式计算：将每种糖链种类的绝对量除以其所含的甘露糖残基数。随后，将该值除以所有糖链种类的相对摩尔量之和，从而得到每种特定糖链种类的“占总量百分比”。
| 脉冲追踪时间（小时） | 0 | 4 |
| 经内切酶H释放的（cpm）a | 90000 | 16800 |
| 经N-糖苷酶F释放的（cpm）b | 20400 | 3900 |
| 截留液中的糖蛋白（cpm）c | 371700 | 127695 |
| 截留液中的焦磷酸多萜醇-寡糖（cpm）d | 4350 | 540 |
| 截留液中的焦磷酸多萜醇-寡糖（%）e | 1.4 ± 0.7 | 0.2 ± 0.2 |
表1. 使用去糖基化酶分析糖蛋白样品中N-连接糖链的释放以及多萜醇-寡糖的存在情况。
我们将脉冲-追踪实验方法应用于NIH 3T3细胞的裂解液。经过Microcon过滤后，在脉冲标记阶段，标记的N-连接寡糖主要通过内切糖苷酶H（endo H）释放（高甘露糖型）；而在追踪阶段进一步用N-糖苷酶F处理后释放的寡糖则对应于复杂型（高尔基体加工后的糖链），即对endo H耐受的寡糖。该定量分析结果表明，在初始截留物中，磷酸多萜醇-寡糖仅占标记物的极小部分。
注意事项：
- 采用[2-3H]甘露糖对NIH 3T3细胞进行脉冲标记，随后用完全培养基进行追踪。细胞裂解后，通过Microcon YM30过滤，截留物中的高甘露糖型N-连接寡糖经内切糖苷酶H（endo H）孵育释放。
- 将(a)中Microcon截留物的endo H耐受性物质进一步与N-糖苷酶F孵育，释放的寡糖通过闪烁计数器测定。
- 在进行endo H处理前，按(a)方法获得的Microcon截留物，用氯仿:甲醇:水（10:10:3）提取4次以去除前体糖脂，未被提取的物质溶于1N NaOH中，并用闪烁计数器计数。
- 从(c)的提取物中纯化出多萜醇-寡糖，纯化方法如步骤1所述，并用闪烁计数器计数。
- 三次实验的平均值，表示截留物中（c+d）总cpm中多萜醇-寡糖（d）所占的百分比。
代表性结果
图1. 未经处理及蛋白酶体抑制条件下NIH 3T3细胞总糖蛋白的脉冲追踪分析。 经[2-3H]标记1小时脉冲后，获得预期的图谱：部分带有葡萄糖的前体仍存在（Glc2Man9GlcNAc2（G2M9）和G1M9），但大部分标记信号出现在M9和M8组分中，后者是所有葡萄糖及一个甘露糖残基被切除后的产物（图1 A）。未检测到游离甘露糖或其他小分子前体，表明纯化过程彻底。经过较长时间（8小时）的追踪后，进一步修剪生成更多的M7-6组分以及少量M5组分，但主要组分仍为M9和M8（图1 B）。若在蛋白酶体抑制剂（30 μM MG-132）存在下进行追踪，则这些被修剪的组分仅有轻微累积（图1 C）。
图 2. 内质网相关降解（ERAD）底物与总糖蛋白的糖链定量分析。（A） 在与图 1 类似的实验中，根据甘露糖含量计算每种寡糖组分的相对摩尔量。我们将每种糖链组分测得的每分钟计数（cpm）值进行换算，然后将各组分占所有组分总摩尔量百分比随追踪时间的变化绘制成图，数据为两次实验的平均值。（B） 与（A）类似，但分析的是在脉冲标记后、追踪时间长达 4 小时的情况下，从 ERAD 底物 ASGPR H2a 释放的糖链，实验在存在或不存在蛋白酶体抑制剂 MG-132 的条件下进行。（C） 比较（A）和（B）中在 MG-132 存在下 4 小时追踪时间点的 ASGPR H2a 与糖蛋白池的数据。（D） 内质网中 N-连接糖链修剪过程的示意图。导致与蛋白质（R）相连的 M6-5 结构的糖链修剪过程促使蛋白靶向进入 ERAD，而保留 M9-8 结构的糖蛋白则可转运至高尔基体及更远区室。结果表明，ERAD 过程与 N-连接糖链的甘露糖修剪相关，最终生成保留 5–6 个甘露糖残基的糖链组分。
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讨论
利用高效液相色谱分离技术对活细胞中的糖链进行脉冲-追踪分析，为研究糖蛋白生命周期中寡糖结构变化的动态过程提供了一种方法。越来越多的证据表明，此类结构变化参与了内质网（ER）中蛋白质折叠、质量控制及运输系统信号的产生2-5。该方法不仅可用于特定目标糖蛋白的研究，也可用于分析总体糖蛋白结构的动态变化。本文即通过此方法比较了特定内质网相关降解（ERAD）底物与细胞内糖蛋白群体的不同命运。该纯化技术操作简便且具有高度特异性。通过使用特异性去糖酶和分子筛过滤，可确保仅获得由糖蛋白释放的N-连接型糖链，而其他被[2-3H]Man标记的大分子物质（如O-连接糖链和GPI锚定蛋白）则被有效去除。来自十一异戊二烯醇（dolichol）前体释放的寡糖仅造成可忽略的污染（表1）。
该方法仅需极少量起始材料即可实现高灵敏度检测。当预期产量极低时，可通过SpeedVac减少HPLC组分的体积，进一步提高检测灵敏度。因此，可克服闪烁液溶解度的限制，从而在闪烁计数器中对组分的全部内容进行监测。
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致谢
感谢 Zehavit Frenkel 和 Sandra Tolchinsky 提供的技术支持。本研究工作得到了以色列科学基金会（1229/07）和德以项目合作计划（DIP-DFG）资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 600E 多溶剂输送系统控制器 | 沃特斯 | WAT062710 | |
| 乙腈 LiChrosolv（液相色谱梯度级） | 默克 & Co., Inc. | 1.0003 | |
| Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K 或 Centricon Ultracel YM-30 | EMD Millipore | UFC503024 或 4208 | |
| 浓缩仪 5301，含 48 × 1.5 / 2.0 ml 固定角转子 | Eppendorf | 5301 000.016 | |
| 透析后的F–胎牛血清 | 生物工业公司 | 04-011-1A | |
| 杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 培养基 | GIBCO，Life Technologies 公司品牌 | 41965039 | |
| 杜尔贝科’s 改良伊格尔’s Medium - 无葡萄糖 | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| 杜尔贝科’磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| EDTA 二钠盐（Titriplex III） | 默克 & Co., Inc. | 1084180250 | |
| Endo Hf 试剂盒（1,000,000 单位/毫升） | New England Biolabs | p0703S | |
| F–胎牛血清（FCS） | 生物工业公司 | 04-001-1A | |
| Frac-100 自动组分收集器 | Amersham | 18-1000-77 | |
| LS 6500 液体闪烁计数系统 | 贝克曼库尔特公司 | 510720 | |
| 甘露糖，D-[2-3H(N)]-（比活度：15-30 Ci/mmol） | PerkinElmer, Inc. | NET570A | |
| N-羰基苄氧基-亮氨酰-亮氨酰-亮氨酸醛（MG-132） | Calbiochem | 474790 | |
| N-糖苷酶 F（1000 单位/毫升） | 罗氏集团 | 11365177 | |
| 正辛基葡萄糖苷 | Sigma-Aldrich | O3757 | |
| NIH 3T3 细胞 | 美国典型培养物保藏中心 | CRL-1658 | |
| Opti-Flour | 珀金埃尔默股份有限公司 | 6013199 | |
| 磷酸溶液（49-51%，用于高效液相色谱） | Fluka | 79607 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| 蛋白A-Sepharose珠 | Repligen | IPA300 | |
| 兔多克隆抗H2羧基末端 6 | |||
| 脱氧胆酸钠 | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| 十二烷基硫酸钠 | 伯乐（Bio-Rad） | 161-0301 | |
| 磷酸钠 | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| 丙酮酸钠溶液（100 mM） | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Spherisorb NH2 色谱柱，5 μm，4.6 × 250 mm | 沃特斯 | PSS831115 | |
| Triton X-100 | VWR | 306324N | |
| Vibra-Cell 超声波处理器 VCX 750 | Sonics and Materials, Inc. | 690-003 | |
| <强>缓冲液A： 1% Triton X-100，0.5% w/v 脱氧胆酸钠，蛋白酶抑制剂混合物 2% v/v，溶于 PBS | |||
| <强>缓冲液B： 0.5% w/v SDS，蛋白酶抑制剂混合物 2% v/v，溶于 PBS | |||
| <强>缓冲液 C： N-糖苷酶F反应缓冲液：200 mM Na3PO4，pH 8.0，4 mM EDTA，1.5% 正辛基-β-D-葡萄糖苷 | |||
| 稳定表达 H2a 的 NIH 3T3 细胞 6 | |||
| <强>缓冲液D： 0.5% Triton X-100，0.25% w/v 脱氧胆酸钠，0.5% w/v SDS，蛋白酶抑制剂混合物 2% v/v，溶于 PBS | |||
| <强>缓冲液 E: 0.5% w/v SDS，1% v/v 2-巯基乙醇–乙醇，蛋白酶抑制剂混合物（2% v/v，溶于PBS） | |||
| 2-巯基–乙醇 | Sigma-Aldrich | M3148 |
参考文献
- Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).
- Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
- Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2. J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).
- Hosokawa, N. Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I. J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).
- Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure. J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).
- Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide. J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).
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