真核生物多聚核糖体图谱分析

摘要

本文介绍了一种从真核细胞中提取正在翻译的核糖体的实验方案。提取后，通过蔗糖梯度分级分离将核糖体分为单体核糖体和多聚核糖体，从而实现对不同核糖体群体的分析。因此，该方法是研究翻译调控的金标准。

摘要

蛋白质合成是一个在多个层面受到调控的复杂细胞过程。例如，多种细胞应激（如氨基酸饥饿或生长因子撤除）可在翻译起始阶段或延伸阶段抑制整体翻译水平。此外，单个mRNA的翻译也可通过mRNA的亚细胞定位或特异性microRNA的存在进行调控。对蛋白质合成的研究常采用多聚核糖体分析，以揭示翻译调控机制或蛋白质合成缺陷。在该实验中，从真核细胞中分离mRNA/核糖体复合物。利用蔗糖密度梯度离心，可将结合多个核糖体的mRNA（即多聚核糖体）与结合单个核糖体（单体核糖体）的mRNA分离开来。通过梯度分级收集，可分离并定量不同类型的核糖体群体及其结合的mRNA或蛋白质。在特定条件下，多聚核糖体与单体核糖体比例的变化可能提示翻译起始或延伸/终止过程存在缺陷。对多聚核糖体组分中mRNA的分析，可揭示在不同实验条件下被翻译的特定mRNA群体是否发生变化。此外，通过分析梯度中分离出的小核糖体亚基和大核糖体亚基的峰形，还可监测核糖体的组装情况。本视频介绍了一种从酵母细胞制备粗核糖体提取物、通过蔗糖梯度离心分离提取物并解读结果的方法。该方法可便捷地适用于哺乳动物细胞。 多聚核糖体分析, 蔗糖密度梯度离心, 蛋白质合成, 翻译调控, 核糖体, mRNA, 酵母, 哺乳动物细胞

方案

1. 7-47% 蔗糖梯度的制备

1. 在使用前一天制备蔗糖梯度，以使梯度充分连续。配制含有 50 mM NH₄Cl、50 mM Tris-乙酸盐（pH 7.0）和 12 mM MgCl₂ 的无菌 7% 和 47% 蔗糖溶液，并于 4°C 保存¹。
2. 为制备 6 条梯度，将 7% 和 47% 蔗糖储备液混合，分别配制成以下各浓度的蔗糖溶液各 48 mL。向每种蔗糖溶液中加入 DTT（1 M 储备液），使其终浓度为 1 mM。
   

   终浓度	7% 蔗糖	47% 蔗糖
   7%	48 mL	0
   17%	36 mL	12 mL
   27%	24 mL	24 mL
   37%	12 mL	36 mL
   47%	0	48 mL

3. 为灌注梯度，将 Pasteur 吸管连接至 20 mL 注射器，并用 Parafilm 密封固定，或使用长针头。在 1 × 3.5 英寸聚丙烯超速离心管底部加入 7 mL 7% 蔗糖溶液。随后，将 Pasteur 吸管尖端置于管底附近，以不超过 0.3 mL/秒的速度缓慢加入 7 mL 17% 蔗糖溶液，使其位于 7% 溶液下方。依次加入各 7 mL 的 27%、37% 和 47% 蔗糖溶液。应可观察到各层之间有清晰的分界线，表明混合程度最小。将梯度连同将用于收集样品的转子、瓶和管一起于 4°C 过夜保存。

2. 酵母提取物的制备

1. 将125 mL酵母培养物培养至OD₆₀₀为0.8–1.0。向培养物中加入环己酰亚胺，使其终浓度为100 μg/mL，并在30°C下继续振荡15分钟。
2. 同时，配制裂解缓冲液，其中含100 μg/mL环己酰亚胺、200 μg/mL肝素、0.2% DEPC，以及10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、0.1 M NaCl、30 mM MgCl₂。从此步骤开始，所有操作均需在冰上进行。
3. 将培养物倒入250 mL离心瓶中，并加入冰块填充。在4°C下以8,000 × g（SLA-1500转子中约7,250 rpm）离心5分钟。用10 mL预冷裂解缓冲液洗涤沉淀一次，转移至15 mL聚丙烯管中。在4°C下以5,900 × g（SLA-600TC转子中约6,000 rpm）离心3分钟。将沉淀重悬于0.5 mL裂解缓冲液中，转移至1.5 mL离心管，并加入0.5 mL预冷、经烘烤酸洗的玻璃珠。涡旋细胞四次，每次30秒，两次之间在冰上冷却30秒。向1.5 mL离心管中再加入0.5 mL裂解缓冲液。在微量离心机中以最大速度（Eppendorf 5417R微量离心机中约14,000 rpm）于4°C离心10分钟。将上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中。取10 μL至另一离心管，用于测定OD₂₆₀/OD₂₈₀比值（见下文步骤3.1）。将提取物储存于-80°C。

3. 哺乳动物细胞提取物的制备

1. 对于贴壁细胞，在100 mm培养皿中培养至约70%融合度。每11 ml梯度需要一个100 mm培养皿（典型产量约为20 OD₂₆₀单位）。根据梯度体积的大小，按比例线性调整细胞量。对于悬浮细胞，每11 ml梯度大约需要1 × 10⁷个细胞。
2. 裂解前，加入环己酰亚胺至终浓度100 μg/mL，37°C孵育15分钟。将培养皿置于冰上，用预冷的PBS洗涤细胞两次。后续所有步骤必须在0–4°C条件下进行。
3. 通过抽吸彻底去除PBS残留（将培养皿倾斜放置于冰上使其充分沥干），加入1 mL裂解缓冲液，刮取细胞并转移至预冷的1.5 mL离心管中。裂解缓冲液的组分需根据细胞类型和培养条件进行优化。推荐的起始缓冲液组成为：20 mM HEPES-KOH（pH 7.4）、15 mM MgCl₂、200 mM KCl、1% Triton X-100（v/v）、100 μg/mL环己酰亚胺、2 mM DTT和1 mg/mL肝素。关键变量包括镁离子和氯化钾的浓度，以及是否添加非离子型去污剂，以提高细胞骨架或膜结合多聚核糖体的提取效率。通过27号针头反复吹打两次，或使用B型研杵进行5–10次Dounce匀浆来裂解细胞。注射器或匀浆器在使用前应预先冷却。
4. 在预冷的微量离心机中以14,000 × g离心5分钟。将新鲜裂解液转移至蔗糖梯度中（对于哺乳动物细胞，蔗糖梯度使用不含Triton X-100和肝素的裂解缓冲液配制，其余成分如1.2和1.3所述），或立即在液氮中速冻以备后续使用。

4. 梯度离心

1. 将多核糖体裂解液在冰上解冻。取预留的10 μL样品加入1 mL水中，用分光光度计测定OD₂₆₀/OD₂₈₀比值，以确定裂解液中核酸的浓度。按照所述方法培养的酵母菌液，通常可获得50个OD单位的产量。
2. 使用移液器，将枪头轻靠离心管壁靠近梯度液表面处，缓慢将25个OD₂₆₀单位的裂解液加至梯度液上方。对于35 mL梯度液，通常上样500 μL裂解液。可使用裂解缓冲液调整，确保所有梯度液上样体积相等。上样量较少时可获得更好的分辨率。用镊子小心将梯度管放入摆动桶转子的吊桶中。
3. 在4°C条件下，以100,000 × g（Surespin 630转子23,000 rpm）离心4小时。本方案可适用于体积较小的梯度液。

5. 数据与组分的收集

1. 在完成4小时离心前约30分钟，将针头连接至Model 184管穿刺器。将记录笔连接至在线Isco Model UA-5吸光度/荧光监测仪。开启吸光度监测仪电源，使其在分析样品前达到稳定的基线。通过将DI-148U数据采集单元（DATAQ Instruments）连接至图表记录仪，可轻松实现多聚核糖体图谱的电子采集。随后可使用配套的WinDaq软件实时采集图谱并保存以供后续标注。
2. 使用反向流动和快速设置，用50 mL氟化液（Fluorinert）填充注射泵。确保其中无气泡存在。将注射器的软管连接至穿刺管，并短暂开启正向3 mL/min的氟化液流动，以清除软管中的任何气泡。
3. 在流动池末端的软管下方放置废液烧杯或一系列收集管，用于收集流出的样品。
4. 小心地从离心机转子中取出含有蔗糖梯度的聚丙烯离心管，并将其置于冰上（使用空管在冰中预先压出凹槽，以避免扰动梯度）。
5. 如需分析细胞提取物，将梯度管放置于穿刺管上。将管顶部连接至出口并固定。升起底部平台，使针头刺入离心管底部。一旦针头穿透离心管底部，即以6 mL/min的流速开始正向氟化液流动。
6. 当氟化液开始流入管内后，监测在线吸光度监测仪上指针的移动。一旦指针开始移动，将图表记录仪的走纸速度调至60。监测仪将记录OD₂₅₄，起始于游离物质，随后检测40S核糖体亚基，并继续通过多聚核糖体复合物。若需收集组分用于RNA或蛋白质分析，通常每0.2分钟收集一次（1 mL）。对于RNA分析，应直接将组分收集至含有Trizol（Invitrogen）、苯酚或SDS/蛋白酶K的离心管中，具体取决于所选的提取方法。
7. 当多聚核糖体图谱结束时，关闭流向离心管的氟化液流动，并停止吸光度/荧光监测仪的图表走纸。
8. 通过快速启动反向流动，将氟化液从离心管中回吸至注射器内，注意不要将蔗糖溶液吸入注射器。旋下离心管，降低针头，并取下离心管。
9. 对每个蔗糖梯度重复步骤5.5至5.8。
10. 当所有蔗糖梯度分析完成后，将软管中的氟化液快速回吸至注射器中。拆下分部收集装置的各个部件（包括穿刺管和流动池），以及顶部的废液软管，并用清水充分冲洗。

6. 代表性结果

图1. 在环己酰亚胺存在下，从酵母菌株BY4741 (mata his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) 制备的核糖体提取物的代表性图谱。核糖体提取物通过7–47%蔗糖梯度离心分离，并使用连接紫外检测器的泵注射器装置进行分析。图中指出了含有多核糖体以及80S、60S和40S核糖体的峰。

讨论

通过多核糖体图谱获得的信息可为细胞的翻译状态提供有价值的见解。此外，还可确定核糖体亚基自身组装的状态²。例如，图谱中出现半聚体（halfmers）或80S及更大的峰，并在右侧略有肩峰，表明40S亚基已结合但尚在等待60S亚基的结合。在未添加环己酰亚胺或其他延伸抑制剂的条件下进行实验，可分析核糖体“脱离”（run off）的速率，从而判断翻译延伸过程是否发生改变³。所收集的各组分本身是丰富的试剂来源，可用于后续通过Northern印迹或Western印迹分析特定mRNA或蛋白质与核糖体亚群的结合情况。通过关联的微阵列分析⁴或深度测序分析⁵，可确定与活性核糖体结合的全部mRNA池。此外，通过适当添加交联试剂，还可稳定蛋白质的相互作用⁶。

哺乳动物细胞的多聚核糖体分析也值得提及，因其在建立获得稳定多聚核糖体所需条件方面存在明显的困难。文献中报道的缓冲体系差异较大^7-10，因此可能需要针对不同细胞类型对裂解缓冲液进行优化；或者同样有可能的是，缓冲体系的重要性不如在低温条件下使用新鲜裂解物时的细致操作。据我们所知，目前尚未见系统评估影响哺乳动物多聚核糖体形成各参数的相关报道。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚烯烃超速离心管	Beckman Coulter Inc.	326823	1 x 3.5 英寸 (25x89mm)
氟化惰性液（Fluorinert）	Sigma-Aldrich	F9755
环己酰亚胺（Cycloheximide）	Sigma-Aldrich	C-7698
肝素（Heparin）	Sigma-Aldrich	H3393
BY4741	Open Biosystems	YSC1048	其他菌株同样适用