Mikroinjektion von Drosophila Krankenschwesterzellen: Eine Methode der intrazellulären Verabreichung

Overview

Aufgrund ihrer großen Größe und relativ einfachen Organisation sind Drosophila Ammenzellen ideal für Live-Zell-Bildgebungsstudien geeignet. Dieses Video beschreibt eine Mikroinjektionsmethode für die Abgabe von exogenen Verbindungen in die Zellen, und das vorgestellte Protokoll zeigt das Verfahren mit fluoreszierenden Oligonukleotid-Sonden, sogenannten molekularen Baken (MBs), die zur Visualisierung endogenes mRNA-Transkripte verwendet werden.

Protocol

Dieses Protokoll ist aus Catrina et al., Visualizing and Tracking Endogene mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers, J. Vis. Exp. (2019).

1. Design von MBs für Live Cell Imaging

1. Falten Sie die Ziel-RNA-Sequenz, um die sekundäre Struktur des mRNA-Ziels mithilfe der "RNA-Form" vom mfold-Server (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form) vorherzusagen.
   1. Fügen Sie die Zielsequenz im FASTA-Format ein, wählen Sie 5 oder 10 % Suboptimalität (Strukturen mit einer freien Faltenergie innerhalb von 5 bzw. 10 % des MFE-Wertes) und passen Sie die maximale Anzahl berechneter Faltungen entsprechend an (z. B. größer für 10 % Suboptimalität).
      HINWEIS: Die Einbeziehung suboptimaler Sekundärstrukturen bei der Entwicklung von MBs ermöglicht die Identifizierung von Regionen innerhalb der Ziel-mRNA, die flexibler oder starrer sein können als nur für die minimale freie Energiestruktur (MFE) vorhergesagt, was das Gesamtdesign von MBs verbessert, die für die Bildgebung von Lebendenzellen geeignet sind.
   2. Wählen Sie einen "unmittelbaren Auftrag" für mRNA-Ziele von 800 Nukleotiden (nt) oder einen "Batch-Job" für mRNA-Längen zwischen 801 und 8.000 nt aus. Speichern Sie die Datei "ss-count" als einfache Textdatei.
2. Verwenden Sie die in Schritt 1.1 erhaltene Datei "ss-count" als Eingabe für das PinMol-Programm (https://bratulab.wordpress.com/software/) mit den gewünschten Parametern, um mehrere MBs für das mRNA-Ziel zu entwerfen (siehe Tutorials zur Beschreibung der Verwendung des PinMol-Programms bei https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/).
   1. Bestimmen Sie die Spezifität ausgewählter MBs durch BLAST-Analyse: verwenden Sie "blastn" mit der entsprechenden Datenbank (z.B. für oskar mRNA-spezifische MBs verwenden Sie die "refseq-rna"-Datenbank und den Drosophila-Melanogaster-Organismus).
   2. Identifizieren Sie jede gewebespezifische Expression des mRNA-Ziels (z. B. für oskar mRNA Flybase> High-Throughput Expression Data> FlyAtlas Anatomy Microarray oder modENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) und mit allen positiven BLAST-Treffern vergleichen. Beseitigen Sie Sonden, die >50% Cross-Homologie mit anderen mRNAs zeigen, die auch im Gewebe/der Zelle von Interesse ausgedrückt werden.
3. Wählen Sie das Fluorophor- und Das Quencher-Paar aus, das für die Mikroskopie-Einrichtung geeignet ist, die für die Live-Zell-Bildgebung zur Verfügung steht (z. B. Cy5/BHQ2).

2. MB Synthese, Reinigung und Charakterisierung

1. Verwenden Sie die interne Synthese und Reinigung, wie zuvor in Bratu, Methods in Molecular Biology (2006) beschrieben,oder Dienstleistungen von kommerziellen Anbietern, um ein bis fünf MBs zu synthetisieren und zu reinigen (siehe obenan. Reinigen Sie MBs mit Reverse-Phase HPLC, im Haus oder mit den Dienstleistungen des kommerziellen Anbieters.
   HINWEIS: Die phosphoramiditen, die für die automatisierteSondensynthese verwendet werden, müssen die 2'- O-Methylribonukleotid-Modifikation haben. Man kann auch Chimären von abwechselnden Sperrnukleinsäure (LNA)und 2'- O-Methylmodifikationen verwenden, um die Stabilität eines Hybriden zwischen einem kürzeren MB und seiner Ziel-mRNA zu erhöhen.
2. Synthetisieren Sie DNA-Oligonukleotide, die der Sequenz der zielgerichteten RNA-Region entsprechen und somit die Sondenregion von MBs ergänzen, zur Verwendung in der In-vitro-Charakterisierung (siehe Schritte 2.3 bis 2.5; oben Anmerkung). Maximieren Sie die Hybridisierung des MB mit dem DNA-Oligonukleotid-Ziel mimik, indem Sie an jedem Ende des DNA-Ziels vier zusätzliche Nukleotide einbeziehen, wie in der Ziel-mRNA-Sequenz gefunden.
   HINWEIS: Eine strengere Charakterisierung der Effizienz des MB zum Nachweis der Zielsequenz kann mit in vitro synthetisierten RNA-Zielen anstelle komplementärer DNA-Oligonukleotide durchgeführt werden.
3. Führen Sie die thermische Denaturierung des MB allein durch, messen Sie seine Schmelztemperatur (Tm) und bestätigen Sie, dass das MB die gewünschte Haarnadelform bei physiologischer Temperatur annimmt. Wir haben Tm-Werte zwischen 60 und 90 °C beobachtet.
4. Führen Sie die thermische Denaturierung des MB in Gegenwart des DNA-Oligonukleotidziels durch und messen Sie das Tm des MB:DNA-Zielhybrids, wie zuvor in Bratu, Methods in Molecular Biology (2006)beschrieben. Für den MB:DNA-Hybrid wird ein Tm zwischen 55 und 60 °C gewünscht.
5. Führen Sie In-vitro-Hybridisierungsreaktionen mit dem entsprechenden DNA-Oligonukleotid-Ziel durch und bestimmen Sie die Effizienz der MB:DNA-Hybridbildung bei physiologischer Temperatur, wie zuvor in Bratu, Methods in Molecular Biology (2006)beschrieben. Schnelle Hybridisierungskinetik mit der DNA-Zielmimik ist erwünscht, aber MBs, die keine hohe Hybridisierungseffizienz mit DNA-Targets aufweisen, können eine bessere Leistung mit der Ziel-mRNA in vitro und/oder in vivo aufweisen.

3. Zerlegung und Vorbereitung einzelner Eierkammern zur Mikroinjektion

1. Füttern Sie frisch geschlüpfte, gepaarte Weibchen für 2-3 Tage mit frischer Hefepaste.
2. Anästhesisieren fliegt auf einem CO_2-Pad und überträgt mit einer feinen Pinzette (Dumont #5) 1-2 Weibchen in einen Tropfen Halocarbonöl 700 auf einem Glasdeckel-
3. Mit einer Pinzette orientieren Sie die Fliege mit der dorsalen Seite unter einem Stereomikroskop nach oben. Sezieren Sie den weiblichen Bauch, indem Sie einen kleinen Schnitt am hinteren Ende machen und drücken Sie das Paar Eierstöcke sanft in das Öl.
4. Die Eierstöcke auf einen Öltropfen auf einem neuen Deckelabrutsche abpflanzen. Halten Sie vorsichtig einen Eierstock mit einer Pinzette, während Sie die jüngsten Stufen des Ovariole mit der anderen Pinzette abkniffen. oskar mRNA ist aktiv lokalisiert an und nach der MittlerenOogenese (Stadien > 7), und jüngere Eikammern (Stadien < 7) sind schwieriger zu injizieren und überleben nicht so lange. Ziehen Sie langsam auf den Deckelschlupf (mit einer Abwärtsbewegung), bis einzelne Eizellen oder Eikammern isoliert und vertikal ausgerichtet sind. Weitere trennen einzelne Eikammern durch Verdrängung der unerwünschten Stadien von der eiförmigen Eikette.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass individuell gehänselte Eierkammern nicht im Öl schwimmen und dass sie am Deckelschlupf haften. Dies ist sowohl für eine erfolgreiche Mikroinjektion als auch für die Bildaufnahme wichtig.

4. Mikroinjektion von MBs in die Pflegezellen von Eierkammern

1. Bereiten Sie die MB-Lösung mit einem molekularen Leuchtfeuer (z. B. osk2216Cy5) oder einer Mischung aus zwei MBs vor, die auf verschiedene mRNAs abzielen und mit spektral unterschiedlichen Fluorophoren (z. B. osk2216Cy5 und drongo1111Cy3) gekennzeichnet sind. Verwenden Sie eine Konzentration von 200-300 ng/l pro MB in HybBuffer (50 mM Tris-HCl - pH 7,5, 1,5 mM MgCl₂ und 100 mM NaCl). Für einen Cocktail aus vier MBs, die mit demselben Fluorophor gekennzeichnet sind und die jeweils auf dieselbe mRNA bei 200 ng/l in HybBuffer abzielen (z. B. osk82, osk1236, osk2216). Drehen Sie die MB-Lösung unmittelbar vor dem Laden der Nadel für die Mikroinjektion herunter.
2. Wählen Sie das Ziel aus. Ein 40-faches Ölobjektiv wird empfohlen, um eine geeignete Eikammer zu finden und mikroinziert zu werden.
3. Montieren Sie den Deckelrutsch mit sezierter Eikammer auf die Mikroskopbühne. Bringen Sie das Ziel in der Fokusposition auf und identifizieren Sie eine Eikammer in einem mittleren bis späten Entwicklungsstadium, die für die Mikroinjektion richtig ausgerichtet ist (d.h. mit der A-P-Achse senkrecht zur Nadelspitze, um eine einfache Injektion innerhalb einer Ammenzelle proximal zur Eizelle zu ermöglichen).
4. Laden Sie eine Nadel (kommerziell oder im Haus zubereitet) mit einer Lösung von 1 L MB (siehe Schritt 1.1) und schließen Sie sie an den Mikroinjektor an. Bei Mikroinjektionen in D. melanogaster Eikammern die Nadel (siehe Materialtabelle)in einem Winkel von <45° an der Mikroskopstufe (z.B. 30°) orientieren, um das Durchsatzen mehrerer Pflegezellen zu vermeiden.
5. Einrichten des Injektors mit einem Einspritzdruck von 500-1.000 hPa und einem Kompensationsdruck von 100-250 hPa (siehe Materialtabelle).
6. Bewegen Sie langsam die Bühne, um in das Sichtfeld einen Bereich des Öltropfens leere Eikammern zu bringen.
7. Mit dem Mikromanipulator-Joystick senken Sie die Nadel vorsichtig in den Öltropfen und bringen ihre Spitze in den Fokus zur Peripherie des Sichtfeldes.
8. Führen Sie eine "saubere" Funktion aus, um die Luft von der Nadelspitze zu entfernen und sicherzustellen, dass es Einen Fluss von der Nadel gibt.
9. Bringen Sie die Nadel in die Heimatposition und konzentrieren Sie sich auf die zu mikroinjizierende Eikammer, dann bringen Sie die Nadel wieder in den Fokus und positionieren Sie sie in der Nähe des Rands der Eikammer.
10. Führen Sie eine Feineinstellung der Z-Position des Objektivs durch, so dass die Membran, die die Follikelzellen von Pflegezellen trennt, im Fokus steht.
11. Setzen Sie die Nadel in eine Ammensamenzelle ein und führen Sie eine Injektion für 2-5 s durch.
12. Entfernen Sie die Nadel vorsichtig und ziehen Sie sie in die Heimatposition ein.
13. Ändern Sie das Ziel in die gewünschte Vergrößerung für die Bildaufnahme (60-63x oder 100x), konzentrieren Sie sich auf die Eikammer und beginnen Sie mit der Erfassung.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrofluorometer	Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon	n/a	Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette	Fireflysci (former Precision Cells Inc.)	701MFL
Dumont #5 tweezer	World Precision Instruments	501985	Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm	VWR	48393-048
Dissecting microscope	Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.	n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad	Genesee Scienific	59-114
Tris-HCL pH 7.5	Sigma-Aldrich	1185-53-1
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7791-18-6
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Spinning disc confocal microscope	Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.	n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera	Hamamatsu	n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator	Eppendorf Inc.	920000037
FemtoJet Microinjector	Eppendorf Inc.	920010504
Injection needle: Femtotips II	Eppendorf Inc.	930000043
Loading tip: 20 μL Microloader	Eppendorf Inc.	930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm	VWR	48393-026; 48393-172
Dry yeast	Any grocery store	n/a
Computer, > 20 GB RAM			Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing