Drosophila Ensaio de preferência de colocação de ovos: um método para testar a tomada de decisões em moscas

Overview

As fêmeas de drosophila escolhem entre substratos e locais selecionados que são atraentes para a colocação de ovos. Este vídeo descreve um ensaio comportamental que testa sua tomada de decisão, chamado ensaio de preferência de colocação de ovos. O clipe em destaque demonstra o procedimento com uma configuração personalizada, que permite aos pesquisadores não apenas testar o comportamento de muitas mulheres ao mesmo tempo, mas também é compatível com gravação de vídeo e configurações optogenéticas.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Gou et al., High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2016).

1. Construção de Câmara, Montagem, Instalação de Ensaios

1. Faça uma oficina construir câmaras de colocação de ovos acrílicos(Figura 1A-D). O desenho de engenharia de diferentes peças foi mostrado na Figura Suplementar 1-3. Fotos de alta resolução também podem ser encontradas aqui(http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
2. Insira folhas plásticas na peça de carregamento (superior) da câmara, conforme mostrado na Figura 1C. Isso serve como superfície inferior enquanto carrega moscas em arenas individuais de colocação de ovos.
3. Anestesiar fêmeas em uma almofada de CO₂ e carregá-las individualmente em cada arena de colocação de ovos. Permita ~30 min para que as moscas se recuperem do CO₂ e se aclimatem ao novo ambiente.
4. Prepare os substratos agarose.
   1. Por conveniência, mantenha uma garrafa pré-feita de 1% de rega em um banho de água de 55 °C.
   2. Adicione a quantidade desejada de solução de sacarose de estoque (2 M) em um tubo cônico de 50 ml e misture-a com a quantidade apropriada de agarose. Por exemplo, para preparar o substrato de sacarose de 150 mM, coloque 750 μl de solução de sacarose de 2 M no tubo e, em seguida, encha o tubo com agarose até a marca de 10 ml.
   3. Prepare o substrato simples da mesma forma, mas adicione água destilada em vez de solução de sacarose.
      NOTA: A concentração final de agarose neste protocolo é ligeiramente inferior a 1%. Em nossa experiência, a concentração exata de agarose não importa desde que seja controlada para estar dentro de ~0,9 - 1,1% e que os dois substratos são da mesma concentração de ágarose.
5. Pegue o substrato (inferior) da câmara e a pipeta 1.000 μl de substrato agarose em cada cocho, como visto na Figura 1D.
6. Permita que agarose solidifique por ~30 min.
7. Uma vez que os substratos e moscas agarose estejam prontos, monte todos os três pedaços da câmara de colocação de ovos e, em seguida, tire as folhas de plástico.
8. Coloque as câmaras em incubadoras de moscas.
   NOTA: O comprimento dos experimentos de colocação de ovos pode variar dependendo das necessidades experimentais. Normalmente executamos o experimento O/N (14 - 16 hr). Além disso, não foi observado nenhum impacto significativo do tempo circadiano nas preferências de colocação de ovos.
9. Anestesiar fêmeas injetando CO₂ na câmara. Desmonte a câmara, descarte as moscas anestesiadas no necrotério de moscas (ou seja,uma lata de café vazia cheia de óleo de milho). Tire fotos dos resultados para registro (ver Figura 2).
10. Conte o número de ovos manualmente e calcule os índices de preferência para análise. Calcule o índice de preferência como (N_a - N_b)/(N_a + N_b) onde N_a e N_b representam número de ovos no local a vs. site b, respectivamente.

Representative Results

Figura 1: Câmaras de colocação de ovos e protocolo de colocação de ovos. (A) Câmara de fixação de ovos totalmente montada. (B) Peças desmontadas. a: a peça de carregamento (superior), b: a peça divisora (meio), c: a peça do substrato (inferior). Os desenhos de engenharia dessas peças são mostrados na Figura Suplementar 1-3. (C) A peça de carregamento da câmara. a': portas deslizantes, a": trilhos. As folhas plásticas são inseridas na peça de carregamento para servir como piso para manter as moscas carregadas no lugar. Normalmente colocamos fitas coloridas na borda das folhas de plástico (seta vermelha). (D) O substrato (inferior) e o divisor (médio) pedaços da câmara. Agarose é depositada em cochos individuais para servir como substratos de colocação de ovos (setas). Quadrilateral descreve a arena de colocação de ovos para uma única mosca. (E) Dia 0 de fêmeas/machos coletados em um frasco de leveduras. (F) Dia 4 - 5 de fêmeas/machos coletados em um frasco de levedura. Note que larvas e fêmeas adultas comeram a maior parte da levedura e a superfície do alimento tornou-se ocupada por larvas. O alimento da superfície molhada que rasteja com larvas impede que as fêmeas posuam mais ovos no frasco. (G) Esquema representando o protocolo para a criação de experimentos de comportamento de colocação de ovos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Resultados representativos de criação de ovos para moscas Escolhendo entre sacarose e substratos simples. (A) Visão lateral dos resultados de colocação de ovos de moscas do tipo selvagem quando foram dadas uma escolha entre sacarose (150 mM) e substratos simples. A caixa branca esboça uma arena de colocação de ovos para uma única mosca. (B) Visão superior dos resultados de colocação de ovos. A caixa branca esboça uma arena de colocação de ovos para uma única mosca. (C) Índice de preferência (PI) de moscas do tipo selvagem quando solicitado a escolher entre um substrato contendo sacarose e um substrato simples. Pi para cada fêmea é calculado da seguinte forma: (número de ovos no substrato de sacarose - número de ovos nos substratos simples)/número total de ovos. A barra de erro indica SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura Suplementar 1: Desenhos de Engenharia para o Divisor e a Peça Substrato da Câmara. (A-A) Diferentes pontos de vista do substrato da câmara. (B-B) Diferentes pontos de vista da peça divisora do meio da câmara. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura Suplementar 2: Desenhos de Engenharia para a Peça de Carregamento da Câmara. (A-A) Diferentes pontos de vista da camada superior da peça de carregamento da câmara. (B-B) Diferentes pontos de vista da camada inferior da peça de carregamento da câmara. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura Suplementar 3: Desenho de Engenharia para a Porta De Correr e o Trilho na Câmara. (A) O trilho fixado na parte superior da câmara. (B) A porta de correr para a câmara. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500
Sucrose	Sigma	S0389
Water bath	Fisher	15-462-6Q
Egg-laying chambers	Custom Built
Fly vials (narrow)	Genesee	32-116BC