Augenlinsen-Dissektion: Eine Technik zur Beobachtung der Morphologie von Zebrafischlinsen

Overview

Dieses Video beschreibt das Protokoll, das entwickelt wurde, um erwachsene und Larven-Zebrafischlinsen zu sezieren, um kortikale Linsenmorphologie und strukturelle Integrität der Linsennähte zu analysieren.

Protocol

1. Zerlegung von Larval und adulten Zebrafischlinsen

1. Anästhesisieren Sie Fische von 6 dpf Larven bis zum Erwachsenenalter mit Tricain bis nicht ansprechbar zu berühren, aber immer noch zeigt einen starken Herzschlag. Messen Sie die Fischstandardlänge nach Schilling (2002) für die Inszenierung.
2. Sofort die Augen mit einer Mikrosektionsschere verbrauchen und in eine Sezierschale in PBS legen (Abbildung 1 für erwachsene Augen).
   1. Machen Sie eine benutzerdefinierte 35-mm-Schale gefüllt mit Silikon für Linsensezierungen. Sobald Silikon gesetzt ist, verbrauchen Sie einen Divot um 2-3 mm im Durchmesser und 0,5 mm tief für die Immobilisierung von erwachsenen Augen / Linsen während der Zerlegung.
3. Dissektion von erwachsenen Zebrafischlinsen
   1. Legen Sie ein erwachsenes Auge in die Schale divot hintere Seite mit PBS gefüllt. Immobilisieren Sie das Auge, indem Sie Zangen im <45°-Winkel durch die optische Scheibe einsetzen. Achten Sie darauf, die Linse nicht zu nicken oder zu komprimieren. Machen Sie zwei oder drei radiale Einschnitte durch Netzhaut und Sklera von der optischen Scheibe in die Ziliarzone mit Einer Sezierschere.
   2. Schälen Sie die Netzhaut und Sklera wie Blütenblätter und invertieren Sie das Auge, Hornhaut Seite nach oben. Immobilisieren Sie die Linse indirekt durch Manipulation der Sklera und Hornhaut mit der flachen Seite der Schere, während die Netzhaut und das angehängte Gewebe mit Zange weggezogen werden. Sorgfältig überschüssiges Gewebe aus der Linse schneiden.
      HINWEIS: Es ist wichtig, sorgfältig zu sezieren, um durchgängig gesunde Linsen zu erhalten.
4. Zerlegung von Larvenzebrafischlinsen
   1. Legen Sie ein Larvenauge hintere Seite auf den flachen Teil der Silikonschale mit PBS gefüllt und verwenden Sie eine geschärfte Wolframnadel, um radiale Schnitte durch die Netzhaut und Sklera zu machen, während das Auge mit einer anderen Wolframnadel oder Zange immobilisieren.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die Linse nicht zu beschädigen.
      1. Schärfen Sie die Spitze einer 2 cm Länge von 0,1 mm Wolframdraht elektrolytisch, indem Sie die Drahtspitze in 10% (w/v) NaOH aufhängen und einen Niederspannungs-Wechselstrom anwenden14. Sichern Sie die Nadel in eine Pasteur-Pipette, indem Sie das Glasende mit einem Bunsenbrenner schmelzen.
         HINWEIS: Alternative Feinsektionswerkzeuge können auch verwendet werden.
         ACHTUNG: NaOH ist ätzend.
   2. Schaufeln Sie die Linse vorsichtig aus dem dissoziierten Auge mit einer stumpfen Seite der Nadel und ziehen Sie vorsichtig angehängtes Gewebe weg.

Representative Results

Abbildung 1: Zebrafisch-Linsensektion. (A) Die Augen werden von anästhesierten Fischen seziert und hintere Seite nach oben gelegt (B). (C) Die Augen werden durch Zangen über die optische Scheibe (od) immobilisiert und zwei bis drei radiale Einschnitte werden in Netzhaut und Sklera von der optischen Scheibe bis zu den Zonulen gemacht. (D) Falten Sie die Klappen heraus, um die Linse zu offenbaren. (E) Drehen Sie das Auge nach oben, immobilisieren Sie die Linse indirekt über die Hornhaut und ziehen Sie die Sklera-Retina weg. (F) Verbleibende Netzhaut und Ziliarzone/Zonules von der Linse wegschneiden

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP399
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Dumont #5 forceps	Dumont & Fils		Keep forceps sharpened
Vannas micro-dissection scissors	Ted Pella Inc	1346	Sharp/sharp straight tips
Confocal microscope	Nikon		Eclipse Ti-E
Sodium Hydroxide beads	Fisher Scientific	S612-3	CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2019 Journal of Visualized Experiments Page 2 of 2 respiratory system, corrosive to metals
Disposable Pasteur glass pipets	Fisherbrand	13-678-20A