XTT检测：一种用于评估细胞活力和线粒体活性的比色法检测

摘要

Trendowski, M., 等 脉冲低频超声的产生与定量分析，用于确定未经处理和经处理的肿瘤细胞的声敏感性 J. Vis. Exp. (2015)

本文介绍了XTT实验的方案，该实验是一种比色法，用于评估细胞活力和线粒体活性。

方案

1. XTT 法检测经处理的 U937 和 THP1 细胞的细胞活力和线粒体活性

1. 在进行XTT实验之前，将U937和THP1细胞在相同条件下培养。在超声处理前，用相同浓度范围的MeβCD预处理细胞30分钟。使用与之前相同的超声参数，但此次采用1-3次、每次1秒、间隔1秒的脉冲处理，以产生不同程度的细胞损伤，供XTT试剂盒评估。
   注意：许多步骤直接取自XTT试剂盒说明书，仅为方便感兴趣的实验室而重复列出。
2. 以200 × g离心10分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬于前述生长培养基中，调整细胞浓度至约1 × 10⁵ 个细胞/ml。将U937细胞以每孔100 µl接种于平底96孔微孔板中，每组设三个复孔，然后使用另一块96孔板对THP1细胞重复相同操作。设置3个对照孔，每孔仅加入100 µl完全生长培养基，用于空白吸光度读数。将接种后的微孔板在培养箱中孵育24小时。
3. 使用前，将两份XTT试剂和活化试剂在37 °C解冻。轻轻摇动至溶液澄清。将0.1 ml活化试剂加入5.0 ml XTT试剂中，配制成足够用于一块96孔微孔板检测的活化XTT溶液。对另一块板重复相同配制过程。
4. 向每孔加入50 µl活化后的XTT溶液。将微孔板放回细胞培养用CO₂ 培养箱中孵育2小时。孵育结束后轻轻振荡微孔板，使阳性孔中的橙色均匀分布。使用微孔板读数仪在450-500 nm波长下测定含细胞的检测孔及空白对照孔的吸光度。
5. 可选择使用空白对照孔将微孔板读数仪调零，或从各检测结果中减去其平均值。再次在630-690 nm波长下测定所有检测孔的吸光度，并从450-500 nm测得的数值中减去该波长下的读数。注意：第二次吸光度测定有助于消除实验结果中的非特异性信号。XTT实验对两种细胞系均重复进行了四次。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Iscove改良的Dulbecco培养基  含 NaHCO3 &和 25 mM Hepes	Life Technologies	12440079
Branson SLPe 40kHz 细胞破碎仪  3" （25毫米）杯状喇叭	Branson Ultrasonics	101-063-726	超声处理 设备
提示 100 μ1 和 1,000 μ滤膜吸头	USA Scientific	1120-1840, 1126-7810
100 μ微量移液器	Wheaton	851164
1000 μ微量移液器	Wheaton	851168
Forma Scientific 双室水浴箱 夹套式培养箱	Forma Scientific	3131
XTT细胞增殖检测试剂盒	ATCC	30-1011K
96孔微孔板读数仪	Cole-Palmer	EW-13055-54
U937 人单核细胞白血病细胞	ATCC	CRL1593.2
THP1 人单核细胞白血病细胞	ATCC	TIB-202