染色质剪切：一种利用酶消化法生成染色质片段的方法

摘要

来源：Fuchs, A. R. 等。染色质免疫沉淀实验鉴定慢性淋巴细胞白血病中新的NFAT2靶基因。J. Vis. Exp.(2018)。

本视频介绍了使用微球菌核酸酶进行染色质剪切的实验方案。染色质剪切是染色质免疫沉淀（ChIP）实验流程中的关键步骤，有助于研究人类慢性髓系白血病细胞中蛋白质与DNA的相互作用。在本视频所展示的实验方案中，染色质剪切通过超声处理完成。

方案

1. 固定、细胞裂解和染色质剪切

注意：根据制造商说明书并结合先前所述的改进方法，使用市售的染色质免疫沉淀（ChIP）试剂盒在层流罩内对患者样本和Jurkat细胞进行固定和裂解。

1. 准备一个含有1 mL 37%甲醛的1.5 mL离心管、一个含有1 mL 1.25 M甘氨酸的1.5 mL离心管、一个含有4 mL 1×PBS的5 mL离心管，以及一个装有冰的容器，用于细胞固定。
2. 在细胞经相应孵育时间刺激后，加入32.4 nM佛波酯12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）和1 µM离子霉素以刺激细胞。随后在37 °C、5% CO₂条件下孵育16 h，离心管盖子保持打开状态（为避免污染，可使用透气封口膜）。将5 mL离心管以200 × g离心5 min，弃去上清，用500 µL PBS重悬细胞。
3. 向细胞中加入340 µM甲醛（即加入13.5 µL 37%甲醛）。轻轻吹打混匀后，在室温下孵育2.5 min（Jurkat细胞）或5 min（患者样本）。
   注意：原代细胞需要更长的固定时间，以确保获得理想的染色质剪切效果。
4. 加入125 mM甘氨酸（即加入57 µL 1.25 M甘氨酸）以终止固定反应，再孵育5 min。立即置于冰上，于4 °C以500 × g离心5 min，吸弃上清。
5. 用1 mL预冷的PBS在4 °C、200 × g条件下洗涤细胞两次，每次均通过吸弃去除上清。
   注意：固定完成后，本方案可在此处暂停。固定后的细胞应于-80 °C保存。为检测后续实验中拟使用的抗体表位是否因固定而被遮蔽，可另取样本进行SDS-PAGE凝胶电泳及Western blot分析。该分析按每100 µg蛋白量进行，依据试剂说明书操作。所有αNFAT2抗体稀释比例为1:1000，GAPDH抗体稀释比例为1:10000。Jurkat细胞固定样本使用合适与不合适抗体的示例图像见图1。
6. 用移液器反复吹打，将细胞沉淀重悬于5 mL市售裂解缓冲液1中。将样品置于冰上振荡器中，振荡孵育10 min。
   注意：裂解前可将细胞在液氮中破碎10 s。此步骤适用于Jurkat细胞，但应避免用于原代患者样本。操作时将5 mL离心管置于盛有5–10 mL液氮的专用容器中，停留5 s。操作时需佩戴护目镜和适当的防护手套。
7. 随后于4 °C以500 × g离心5 min，小心用移液器吸除上清。
8. 用移液器反复吹打，将细胞在5 mL市售裂解缓冲液2中充分匀浆，并在冰上振荡孵育10 min。然后于4 °C以500 × g离心5 min，小心用移液器吸除上清。
9. 将细胞沉淀重悬于500 µL（Jurkat细胞）或140 µL（患者样本）剪切缓冲液1中，缓冲液中含1×蛋白酶抑制剂（分别为5 µL或1.4 µL），冰上孵育10 min。
10. 进行染色质剪切时，将步骤1.9中140 µL细胞悬液转移至超声破碎管中（避免产生气泡，若因样本体积不足可重复此步骤）。将管子放入聚焦式超声仪中，设置温度为7 °C，剪切10 min（细胞系）或7.5 min（患者样本），平均入射功率为9.375 W，以获得200–500 bp的DNA片段。
11. 最后在小型离心机中于4 °C以15700 × g离心10 min，将上清转移至新的1.5 mL离心管中。
12. 为检测剪切片段大小是否合适，取20 µL剪切后的染色质样本在1.5% TBE琼脂糖凝胶中进行凝胶电泳分析。Jurkat细胞剪切后高质量与低质量染色质的示例图像见图2。此时方案可暂时暂停。剪切后的染色质应于-80 °C保存。

结果

图 1： 通过 SDS-PAGE 和 Western Blot 检测固定 Jurkat 细胞中抗体性能的示例。 （a）Jurkat 细胞分别固定 0 分钟（条带 A 和 D）、2.5 分钟（条带 B 和 E）或 5 分钟（条带 C 和 F），并比较不同生产商的 αNFAT2 抗体（克隆 7A6）（条带 A-C = 生产商 1，条带 D-F = 生产商 2）。生产商 1 的抗体整体性能更优，即使在固定样本中也表现出更高的亲和力（比较条带 A-C 与条带 D-F）。（b）使用另一生产商的 αN...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
37 % 甲醛 p.a., ACS	Roth	4979.1
1 × PBS	Sigma Aldrich	D8537
1.5 mL 试管振荡器 Thermomixer comfort	Eppendorf	5355 000.011	可用类似仪器替代
M220 聚焦超声破碎仪	Covaris	500295
20× Bolt MES SDS 电泳缓冲液	Thermo Scientific	B0002
Tris 缓冲盐溶液 (TBS-10X)	Cell Signaling	#12498
iBlot 2 蛋白转印装置 	Thermo Scientific	IB21001
iBlot 2 转印膜片，硝酸纤维素膜，标准尺寸	Thermo Scientific	B23001
大型离心机	Eppendorf	5804R	可用类似仪器替代
DNA LoBind 1.5 mL 离心管	Eppendorf	22431021
Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液 (100×)	Thermo Scientific	78440
小型离心机	Thermo Scientific	Heraeus Fresco 17
密度梯度介质 Biocoll（密度 1.077 g/ml）	Merck	L 6115