超声引导植入:一种将胰腺导管腺癌细胞植入成年小鼠的技术

所有涉及动物模型的程序都已经过当地机构动物护理委员会和 Jove 兽医审查委员会的审查。

1. 小鼠的术前准备

注意:建议在手术前 24 小时执行此步骤。

1. 将含有实验小鼠的笼子放在设置为 37°C 的加热器上。
2. 获得新的、干净的笼子，并放置在设置为 37°C 的第二个加热平台上。
3. 用灭菌剂彻底清洁生物安全柜、诱导室和超声 （US） 阶段（参见材料表）。
4. 将 US 阶段的加温功能调至 37°C。
5. 打开麻醉机:调整分管器上的刻度盘，使气流仅限于感应室。打开氧气罐并将流速设置为 1 L/min。将异氟醚蒸发器打开至 2-3%。
6. 将一只鼠标放入感应室中。监测鼠标，直到不再移动且呼吸减慢。
7. 调整分流器上的刻度盘，使气流同时进入感应室和鼻锥。迅速将小鼠从诱导室中移出，将其腹侧卧放在温暖的 US 舞台上，口吻在鼻锥中。
8. 通过观察对脚趾捏合的任何反射反应来测试诱导水平。如果没有，则鼠标已准备好脱毛。
9. 在双眼上涂抹少量眼部润滑剂（见材料表）以防止组织脱水。转动鼠标，使其背侧躺在载物台上。用纸胶带轻轻地将上肢和下肢粘附在载物台上，以最大限度地暴露腹部并将鼠标固定在载物台上。
10. 使用无菌棉签涂抹器将厚厚的脱毛霜涂抹在腹部的左上象限。脱毛剂应涂抹在脾脏的一般区域，并延伸到中线。静置约 1 分钟。
11. 用棉尖涂抹器的另一端轻轻擦去脱毛霜，测试脱毛程度，一旦容易去除，用干燥的纱布垫将腹部擦拭干净。然后用少量温盐水润湿一层干净的纱布，再次擦拭该区域以完全去除脱毛剂。不要直接接触小鼠皮肤超过 2 分钟，以减少化学灼伤的机会。
12. 从腹部充分去除毛发后，将鼠标放回加热器上的新干净笼子中。
13. 当第一只动物在美国舞台上进行脱毛时，可以将下一只动物添加到诱导室中。
14. 在麻醉下一个笼子的小鼠之前，关闭异氟醚并用氧气冲洗诱导室。用消毒剂清洁感应室和 US 载物台/鼻锥。重复步骤 1.5-1.14，直到所有笼子和小鼠都脱毛。
    注意: 可以考虑在植入前一段时间通过暂时停止进食来禁食动物，以尽量减少由于胃和肠中未消化的食物（12-24 小时）而对腹部器官造成的视觉阻塞。不建议限制用水。如果动物禁食，建议在肿瘤注射后注射 1mL 温水 （37°C） 无菌盐水，以防止脱水。

2. 超声引导下植入 PDA 细胞

注意:所有超声程序均使用超声成像机和软件进行（参见材料表）。该传感器的中心频率为 40 MHz，带宽为 22-55 MHz。

1. 调整超声平台，使平台表面与地板平行，调查员面向动物的左侧，动物的头部向右。调整换能器位置，以便获得腹部横向图像（图 1A）。
2. 按照步骤 1.1-1.8 中的说明麻醉要注射的鼠标。按照步骤 1.9 中的说明在 US 平台上稳定鼠标。
3. 将大量温热 （37°C） 超声凝胶涂抹在腹部的无毛部分。
4. 轻轻降低换能器以接触小鼠腹部。根据需要调整换能器，直到胰腺清晰可见。找到左肾和脾脏，以便提供腹腔的准确方向。
   注意:由于换能器位置已更改以允许进入腹部左侧，因此载物台控件上的 X 轴和 Y 轴现在是倒置的。
5. 在 29G x 1/2" 胰岛素注射器（参见材料表）中加入 25μL 肿瘤细胞悬液。注射前用无菌酒精制备垫擦拭针尖，以尽量减少肿瘤细胞在腹壁的接种。
6. 使用钝边镊子抓住皮肤和腹膜壁，以增加所需注射部位的张力。将注射器与超声平台表面成大约 25°-45° 的角度，缓慢地将针头穿过皮肤和腹膜壁。在进行下一步之前，确认针头已刺穿腹膜壁。当针头刺穿腹膜壁时，应该会感觉到一声小的爆裂声。
7. 在超声可视化下，将针头直接引导到胰腺中（图 1B-C）。通过轻轻上下移动注射器针筒来确认针头在胰腺组织内。如果放置正确，当注射器针筒移动时，针尖将保持在胰腺组织内。
8. 缓慢注射肿瘤细胞，并通过在胰腺内形成液体团块来确认细胞被植入所需位置（在超声屏幕上可见，图 1D><）。 注意:按下柱塞时应感觉到一些阻力。小心不要多次刺穿胰腺，因为这会增加渗漏到腹腔的可能性。
9. 一旦注射了全体积的混悬液并且在胰腺中可以看到液体推注，请保持针头静止几秒钟。从小鼠腹部慢慢缩回针头，非常小心不要打扰注射的细胞。
10. 将鼠标放在干净、温暖的笼子里，确保鼠标从麻醉中完全恢复。对所有动物重复此过程。
11. 在麻醉下一只小鼠之前，用消毒剂清洁感应室和 US 载物台/鼻锥。
12. 重复步骤 2.2-2.11，直到所有小鼠都注射完毕。

图 1:超声引导下将 PDA 细胞植入小鼠胰腺。（A） 用于获取腹部器官高分辨率图像的小鼠、超声载物台和超声探头的方向。请注意，载物台和平台已从标准方向旋转 90°，以便轻松进入小鼠腹部的左上象限。（B） 描绘肾脏、脾脏和胰腺识别的超声图像。在这里，注射针位于小鼠腹部。（C） 描绘小鼠胰腺内针头的超声图像。（D） 超声图像描绘了将肿瘤细胞受控注射到胰腺后注射部位的气泡（以蓝色勾勒）。（E） 剖腹手术显示超声引导注射后胰腺中含有 PDA 细胞的液体推注。请点击这里查看此图的较大版本。