原位同种移植物肿瘤移植:一种生成胰腺肿瘤小鼠模型的技术

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 肿瘤移植的准备

1. 动物饲养
   1. 从商业育种供应商处获得通用 C57BL/6 小鼠。
   2. 在以下条件下将家鼠 （5） 放在单独的通风笼中:温度:20-26 °C;湿度 30-70%;照明周期:12 小时光照和 12 小时黑暗。
   3. 使用每周更换的玉米棒垫料。
   4. 对于饮食，在整个研究期间提供辐照灭菌的干颗粒食品。
   5. 对于水，为动物提供免费的无菌饮用水。
2. 供体肿瘤片段制备
   1. 首先通过使用天平称重来监测体重 （BW），并通过卡尺测量来监测荷瘤供体小鼠的肿瘤体积 （TV）。
   2. 当 TV 达到 500-1,200 毫米³ 时，按照方案在生物危害罩中对动物实施安乐死。
   3. 使用 iodophor 拭子对肿瘤周围的皮肤进行消毒。
   4. 按照方案手术切除肿瘤。
   5. 终止前通过目视和触诊检查是否存在可触及的肿瘤。
   6. 对于终止，首先按照批准的方案对小鼠实施安乐死，然后打开腹部并目视检查胰腺是否有肿瘤。
   7. 通过死后手术切除肿瘤并将其添加到冷 PBS 中。将所有动物放入一个干净、未充电、半透明的安乐死室中，该安乐死室带有一个特殊的盖子，该盖子带有一个端口，用于输送要使用的二氧化碳。
   8. 以产生快速失去知觉且对动物的痛苦最小的情况下的流速将气体排放到腔室中。CO₂ 的最佳流速应约为 2–2.5 L/min。
   9. 在安乐死过程中目视观察每只动物，以确保所有动物都获得足够的气体浓度，并且在安乐死过程中不会恢复意识。
   10. 在明显的临床死亡后保持气体流动至少 1 分钟，以尽量减少动物恢复的可能性（如果呼吸暂停但未死亡）。
   11. 去除邻近的非肿瘤组织。清理后的肿瘤可以快速拍照。
       将肿瘤组织放入 RPMI-1640 中，并在解离前保持冰上。
       注意:动物尸体装袋并储存在适当的冰箱中等待取出。
   12. 将肿瘤置于含有 20 mL PBS 的培养皿中（在对动物实施安乐死之前，将培养基或缓冲液预冷至 4 °C）。
   13. 如果有污染的血液，将肿瘤转移到另一个培养皿中，并用 PBS 洗涤肿瘤。
   14. 将肿瘤切成两半，去除任何多余的皮肤、血管、钙化和/或坏死。
   15. 仅选择完整的肿瘤片段，并将其放入无菌的 50 mL 离心管中，加入 20 mL PBS，然后将管运输到单独的动物室进行药理学研究。

2. 胰腺原位植入术

1. 麻醉和镇痛
   1. 使用 2 mL 氯胺酮注射液和 0.42 mL 甲苯噻嗪注射液 （20 mg/mL） 混合在 5.91 无菌注射水或生理盐水中，剂量体积为 0.06-0.1 mL/20-25 g 体重><。 注意:根据动物福利，术前和术后都需要镇痛。0.05–0.1 毫克丁丙诺啡/kg，皮下注射。第一次给药在术前，然后在手术后每 4 小时连续给药 3 次。
2. 原位植入的外科手术
   1. 通过肌内注射 （IM） 麻醉小鼠。用 5% 异氟醚麻醉受体动物，其由鼻锥维持在 1%。动物会开始放松，失去扶正反射，最终变得不动。在这个深度的麻醉下，他们很容易被痛苦的刺激唤醒;让麻醉加深，直到对疼痛的这种反应消失。
   2. 动物完全麻醉后，将小鼠固定在实验板上的右侧位置。
   3. 将鼠标保持在右侧位置。用碘消毒脾脏周围的皮肤，然后用 75% 的乙醇脱碘。
   4. 找到脾的中间点，在腹部做一个 1 cm 的垂直切口，露出脾脏。
   5. 用平尖镊子轻轻吸出脾脏下的一部分胰腺组织，用 9-0 可吸收手术缝合线将种子小鼠的同种移植肿瘤片缝合到受体小鼠的胰腺上。
   6. 用双缝 6-0 丝缝合合腹部。通过压缩实现体内平衡。
   7. 完成肿瘤植入后，如果既没有出血也没有发生肿瘤组织渗漏，请将动物放在温暖的笼子里。
   8. 监测动物，直到它恢复足够的意识以维持胸骨卧位;从麻醉中完全恢复后，将动物送回动物房间。通过触诊脾脏附近的腹部来监测荷瘤小鼠，并挑选出携带原位肿瘤的小鼠。

3. 荷瘤小鼠健康监测

1. 每天检查水和食物的消耗量。
2. 检查小鼠外观是否有未梳理的毛发、肿块、稀疏、呼吸异常或腹水。
3. 触诊腹部，检查肝脏或脾脏是否有自发性肿瘤。
4. 每周使用天平称量小鼠。
5. 如果观察到以下任何临床症状，则处死小鼠进行样本采集和尸检: 体重损失 >20%;行动不便（不能进食或饮水）;由于明显的腹水和腹部增大而无法正常移动;呼吸困难。