自发性转移小鼠模型：研究原位注射结直肠癌细胞转移潜能的平台

摘要

来源：Okazawa, Y.，等。 利用GFP慢病毒转导的患者来源结肠肿瘤类器官培养物进行微转移灶的高灵敏度检测。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频介绍了建立结直肠癌患者来源异种移植瘤（PDX）自发转移小鼠模型的实验方案。这些异种移植模型可部分模拟人类癌瘤的特征，有助于理解人类恶性肿瘤的关键特征，包括侵袭和转移过程。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医评审委员会的审核。

1. 小鼠中结直肠癌PDX模型的解剖

结直肠癌PDX模型解剖的实验步骤如图1B所示（步骤2）。

1. 使肿瘤在皮下生长至约 1 cm³ 大小，通常需要大约 1–3 个月。
2. 使用小动物吸入式麻醉装置通过吸入异氟烷对小鼠进行麻醉，并用 70% 乙醇对皮肤进行消毒。
3. 将小鼠俯卧置于实验台上。切开皮肤，暴露肿瘤，并使用无菌剪刀小心地将皮肤与肿瘤分离。切除肿瘤后，将其置于 10 cm 培养皿中，去除肉眼可见的坏死区域，然后用 5 mL PBS 冲洗两次。
   注意：坏死区域通常比周围组织颜色更白、质地更软、更易碎。
4. 将肿瘤置于冰上，并平均分成至少 4 份，用于不同用途，包括 1）结直肠癌类器官培养，2）移植至继代表型小鼠，3）组织学检查，以及 4）肿瘤组织碎片的冷冻保存。
   1. 为建立结直肠癌类器官，将实体肿瘤组织置于含有 1 mL 无菌 PBS 的 6 cm 培养皿中。处理前保持组织处于冰上。
   2. 为建立人源结直肠癌 PDX 模型，将新鲜的结直肠癌 PDX 组织移植至继代表型小鼠。使用无菌刀片....

结果

图1：在NOG小鼠中通过GFP慢病毒标记的PDX来源的结直肠癌（CRC）类器官生成转移灶的示意图。 (A) 将小块CRC组织皮下植入NOG小鼠（步骤1）。从患者手术切除的CRC组织被切成小块，并皮下植入NOG小鼠体内。s.c.：皮下植入。(B) 从PDX中分离生成CRC类器官（步骤2–4）。将已形成的CRC异种移植瘤组织切碎（步骤2），转移至含有培养基（包括胶原酶）的15 mL离心管中（步骤3）。经缓慢振荡孵育后，对CRC细胞悬液进行过滤（步骤3）。然后，将CRC类器官细胞悬液接种到包被有人工细胞外基质的培养板上，并在CO₂培养箱中过夜.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) 小鼠	 日本神奈川实验动物中央研究所 		在无菌及特定病原体-free条件下饲养6周龄雄性小鼠
伤口夹 2×10 mm 	日本Natsume制造公司 	#C-21-S 	使用前高压灭菌
Zeiss Axioplan 2 体视荧光显微镜	 Zeiss
SW55Ti 摆动桶转子	 Beckman Coulter
pCMV-dR8.2 dvpr 	Robert A. Weinberg 博士惠赠
PRRL-GFP 载体	Robert A. Weinberg 博士惠赠
pCMV-VSV-G	Robert A. Weinberg 博士惠赠
5 ml 聚丙烯离心管 	Beckman Coulter 	326819
Minisart 0.45 µm 滤器 	Sartorius stedim 	17598-K
FuGENE 6 转染试剂 	Roche	 11814 443001
含1%或5% FCS的CRC类器官培养基			DMEM/F-12 培养基含 GlutaMAX™ 补充剂（Gibco #10565018），添加1%或5% FCS、100 U/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素、2 ng/ml hEGF 及 10 µM Y27632（ROCK抑制剂）。4°C 保存，1个月内使用。
培养基 	Gibco		DMEM/F-12 培养基含 GlutaMAX™ 补充剂，添加5% FBS、100 U/ml 青霉素和100 µg/ml 链霉素。4°C 保存，1个月内使用
Hamilton 注射器针头规格：22号 	日本Tokyo Science 		用70%乙醇和无菌PBS消毒。
6孔板 	BMBio 	#92006
12孔板 	BMBio 	#92412
15 ml 锥形管 	住友贝克莱特 	MS-57150
微量离心管 	Eppendorf 	#0030120086 	使用前高压灭菌
50 ml 锥形管 	住友贝克莱特 	MS-57500
血细胞计数板 	Erma 	#03-202-1
40μm 细胞滤网 	Corning 	#352340
Matrigel 基底膜基质	Corning 	#354234 	分装后于-20°C 保存。使用前置于冰上
Ⅰ型胶原酶 	Sigma 	#C1030 	150 mg/ml Ⅰ型胶原酶溶于1×PBS中。分装后-20°C 保存，最长1年
Accutase 	Innovative Cell Technologies 	#5V2623A	 4°C 保存。
DMEM/F-12 培养基含 GlutaMAX™	 Gibco 	#10565018 	4°C 保存。使用前37°C 预热
Cell Banker 1plus 	ZENOAQ 	#628 	4°C 保存。1个月内使用
青霉素 	Gibco 	#15140122	4°C 保存。1个月内使用
链霉素	Gibco 	#15140122	4°C 保存。1个月内使用
hEGF 	PEPROTECH	#AF-100-15 	-20°C 保存。使用当天加入培养基
Y27632，一种ROCK抑制剂	 Wako 	#253-00591	-20°C 保存。使用当天加入培养基