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所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医评审委员会的审核。
1. 小鼠中结直肠癌PDX模型的解剖
结直肠癌PDX模型解剖的实验步骤如图1B所示（步骤2）。
- 使肿瘤在皮下生长至约 1 cm3 大小，通常需要大约 1–3 个月。
- 使用小动物吸入式麻醉装置通过吸入异氟烷对小鼠进行麻醉，并用 70% 乙醇对皮肤进行消毒。
- 将小鼠俯卧置于实验台上。切开皮肤，暴露肿瘤，并使用无菌剪刀小心地将皮肤与肿瘤分离。切除肿瘤后，将其置于 10 cm 培养皿中，去除肉眼可见的坏死区域，然后用 5 mL PBS 冲洗两次。
注意：坏死区域通常比周围组织颜色更白、质地更软、更易碎。
- 将肿瘤置于冰上，并平均分成至少 4 份，用于不同用途，包括 1）结直肠癌类器官培养，2）移植至继代表型小鼠，3）组织学检查，以及 4）肿瘤组织碎片的冷冻保存。
- 为建立结直肠癌类器官，将实体肿瘤组织置于含有 1 mL 无菌 PBS 的 6 cm 培养皿中。处理前保持组织处于冰上。
- 为建立人源结直肠癌 PDX 模型，将新鲜的结直肠癌 PDX 组织移植至继代表型小鼠。使用无菌刀片将肿瘤组织切成小块（5 × 5 × 5 mm3 大小），然后轻轻浸入 50 µL 人工细胞外基质中。随后，将这些组织碎片植入 NOG 小鼠左右侧皮下袋的下部。
- 将麻醉后的小鼠俯卧置于实验台上。使用无菌剪刀在受体小鼠左右侧腹部下部做小切口，以形成用于组织植入的皮下袋，注意避免穿破腹膜。该操作应几乎无出血。
- 将上述制备好的肿瘤碎片轻轻浸入 50 µL 人工细胞外基质中，然后植入小鼠左右侧皮下袋的下部。
- 对接受手术操作的小鼠使用伤口夹缝合切口。确保植入的肿瘤组织位于皮肤下远离切口的位置。
注意：根据尽量减少手术干预的原则，本研究中未给予术后镇痛或抗感染治疗。
- 将小鼠置于加热垫上，并保持胸卧位直至意识充分恢复。待小鼠完全清醒并能用四肢站立时，可将其放回原饲养笼中。为防止捕食行为，不得将手术动物与未手术动物同笼饲养。
- 用于组织学分析时，将样本置于 15 mL 锥形管中，加入 5 mL 10% 中性缓冲福尔马林，室温固定 2 天。
- 用于冷冻保存时，将肿瘤组织切成小块（5 × 5 × 5 mm3 大小），并将样本轻轻浸入 1–1.5 mL 冻存管中的 500 µL 无细胞冷冻液中，随后将冻存管转移至 -80 °C 冰箱中。
2. 结直肠癌类器官培养中PDX组织的细胞悬液制备
CRC PDX 的解离实验步骤如图1B（步骤3）所示。
- 将上述（步骤 1.4.1）制备的肿瘤组织碎片置于一个 10 cm 的培养皿中。
- 使用无菌剃刀片将组织碎片切碎，并转移至含有 8 mL 含 80 µL 胶原酶酶原液（见材料表）的 10% 胎牛血清（FCS）-杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）的 15 mL 圆锥形离心管中。
- 拧紧管盖，并用封口膜包裹管口以防止泄漏。为将切碎的肿瘤组织碎片解离成单细胞悬液，于 37 °C 轻柔振荡 2 小时。注意：此时管中仍会残留大量未消化的组织碎片。
- 在 4 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。用 10 mL 含 10% FCS 的 DMEM 重悬细胞沉淀，制成细胞悬液。
- 为去除未消化的组织碎片，将细胞悬液通过置于 50 mL 圆锥形离心管上的 40 µm 细胞滤器过滤两次。随后，将滤过液在 4 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀置于冰上保存。
3. 在人工细胞外基质上培养的结直肠癌类器官的构建
结肠PDX来源的结直肠癌类器官培养的实验步骤如图1B所示（步骤4）。
- 采用先前描述的人结肠类器官培养方法，配制适用于PDX来源的结直肠癌（CRC）类器官的培养基（参见材料表中"结直肠癌类器官培养基"）。
- 在冰上向12孔板的每个孔中加入150 µL人工细胞外基质（参见材料表），然后在37 °C、5% CO2培养箱中孵育30–60分钟，使凝胶固化。
- 将步骤2.5中获得的细胞沉淀用步骤3.1配制的结直肠癌类器官培养基（含5% FCS）重悬，调整细胞密度至3 × 105 个细胞/mL。随后，将1 mL细胞悬液接种至步骤3.2中已包被人工细胞外基质的培养板中，在37 °C、5% CO2条件下过夜培养。使用血细胞计数板对细胞悬液中的肿瘤细胞数量进行计数，计数时包括单个细胞和多细胞簇（即黏附在一起的细胞团）。
注意：本研究中使用5% FCS以淬灭胶原酶的残余酶活性。
- 次日，小心收集培养基（包括从人工细胞外基质包被的孔板上脱落的漂浮细胞），转移至1.5 mL离心管中，于1,400 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀在冰上用70 µL人工细胞外基质重悬。
- 为提高结直肠癌细胞的存活率，将含有肿瘤细胞的人工细胞外基质覆盖至已贴附于人工细胞外基质包被孔板上的肿瘤类器官细胞表面，在37 °C、5% CO2培养箱中孵育30分钟，使人工细胞外基质涂层固化。随后，加入1 mL含1% FCS的结直肠癌类器官细胞培养基，在37 °C、5% CO2条件下继续培养。
- 每两天更换一次培养基。当结直肠癌类器官生长密集、占据大部分培养基时，可能需要每天更换培养基。
4. GFP 慢病毒颗粒的生成与富集
生成和富集GFP慢病毒颗粒的实验步骤如图1C所示（步骤5）。
- 使用含10%胎牛血清（FCS）的RPMI 1640培养基培养HEK293T细胞，并准备六块10 cm培养皿（2 × 10⁶ cells/dish）6 每皿细胞数）用于后续转染实验。
- 每皿转染时，准备500 µL混合液，其中包含20 µL转染试剂、DMEM及PRRL-GFP质粒（5 µg）12 以及两种慢病毒包装质粒，例如 pCMV-VSV-G（1 µg）和 pCMV-dR8.2 dvpr（5 µg），置于无菌的 1.5 mL 微量离心管中。将混合物于室温下静置 20 分钟，然后将其覆盖至各 10 cm 培养皿中，孵育 18 小时。
- 吸除培养基，每皿加入 5 mL 新鲜的含 10% FCS 的 RPMI 1640 培养基，静置 24 小时。
- 将每皿中的条件培养基收集至50 mL离心管中，共收集30 mL培养基，于4 °C过夜保存。向每皿中加入5 mL新鲜RPMI 1640培养基，静置24 h。
- 将每皿中的条件培养基收集至50 mL离心管中，总共保留30 mL培养基置于冰上。随后弃去细胞。
- 将步骤4.4–4.5中获得的培养基60 mL通过0.45 µm滤膜过滤，以去除细胞，并将滤液分装至十二个5 mL聚丙烯离心管中，用于超速离心。
- 为浓缩病毒，使用水平转子离心机进行离心（参见 材料表) 在 85,327 x g 4 °C下孵育1.5小时。
- 立即移除培养基。为溶解浓缩的病毒沉淀，向十二个管中每管加入250 µL不含FCS的Nutrient Ham's Mixture F-12（F12）/DMEM培养基，并于4 °C过夜孵育。注意病毒沉淀通常不可见。
- 轻轻吹打培养基，收集总共 3 mL 浓缩的 5x GFP 慢病毒原液，其中 presumably 包含带有 10 的 GFP 慢病毒颗粒8 每毫升转导单位（TU/mL）。然后，将十二个1.5 mL微量离心管（每管含250 µL）在无菌条件下于-80 °C保存，可保存长达一年。制备大量原始溶液的小份分装，以避免反复冻融-冻融循环。
5. 在人工细胞外基质上培养的结直肠癌类器官细胞的GFP慢病毒颗粒标记
用GFP慢病毒标记CRC类器官细胞的实验步骤如图1C（步骤6）所示。
- 将第3.6步制备的结直肠癌（CRC）类器官在无干扰条件下培养7-10天，使用无菌细胞刮刀机械收获，并转移至1.5 mL微量离心管中。
注意： 结直肠癌类器官在体外培养中的生长情况取决于患者原始肿瘤的性质。在传代时，应将类器官维持在60-70%汇合度，并以1:2的分割比例接种至新的包被有人工细胞外基质的12孔板中，以避免过度生长。
- 在1,400 × g 条件下离心微量离心管3分钟，弃去培养基，并通过轻柔敲击将细胞沉淀重悬于500 µL PBS中。
- 在1,400 × g 条件下离心微量离心管3分钟，弃去PBS。
- 为解离贴壁的结直肠癌类器官，向管中的细胞沉淀加入500 µL含有蛋白酶和胶原酶的细胞解离溶液，并通过轻柔敲击混匀。随后，将管子在室温下静置10分钟。
- 在1.5 mL微量离心管中，用额外的500 µL含1% FCS的DMEM培养基，非常轻柔地反复吹打细胞悬液数次，以粗略解离细胞。剧烈吹打以获得单细胞会显著降低细胞活力。因此，必须通过轻柔吹打使细胞悬液中仍可见细胞团块。
- 将细胞悬液在1,400 × g 条件下离心3分钟，弃去上清液。
- 在1.5 mL微量离心管中，通过轻柔敲击将细胞沉淀重悬于100 µL 5倍浓缩的GFP慢病毒原液（>108 TU/mL）与400 µL结直肠癌类器官培养基的混合液中，调整浓度至每500 µL含5 × 105 个解离的肿瘤细胞。使用血细胞计数板对细胞悬液中的肿瘤细胞数量进行计数，包括单个细胞和细胞团，方法如前所述（第3.3步）。
- 按照第3.2步所述方法准备包被有人工细胞外基质的12孔板。然后，将第5.7步制备的500 µL细胞悬液加入孔中，并在37 °C、5% CO2 条件下孵育18小时。
- 收集从包被有人工细胞外基质的孔板上脱落并漂浮的细胞培养基，转移至1.5 mL离心管中。在1,400 × g 条件下离心后弃去上清液，并将沉淀在冰上重悬于70 µL人工细胞外基质中。
- 为提高结直肠癌细胞的存活率，将含有肿瘤细胞的人工细胞外基质覆盖至已贴壁于包被有人工细胞外基质的12孔板上的肿瘤类器官上，操作如第3.5步所述。随后，将培养板置于37 °C、5% CO2 培养箱中孵育30分钟，使人工细胞外基质凝固，然后加入1 mL含1% FCS的结直肠癌类器官培养基，在37 °C、5% CO2 条件下继续培养。
- 感染后3天在荧光显微镜下观察细胞，确认由于使用了高滴度的慢病毒颗粒，GFP阳性率接近100%（见图2A）。
- 将结直肠癌类器官继续培养7-10天，以扩增细胞数量，为后续注射至受体小鼠做准备。
6. 通过GFP标记的结直肠癌类器官在受体小鼠中生成转移灶
使用GFP标记的结直肠癌类器官生成转移灶的实验步骤如图1C（步骤7）所示。
- 为将GFP标记的结直肠癌类器官解离为单细胞悬液，使用无菌细胞刮棒机械收获类器官，并转移至1.5 mL离心管中，具体操作如上文所述（步骤5.1）。
- 将微量离心管在1,400 x g条件下离心3分钟 g，移除培养基，通过轻柔敲击以500 µL PBS重悬细胞沉淀。
- 将微量离心管以1,400 x g离心3分钟 g 并去除 PBS。
- 在离心管中的细胞沉淀上覆盖500 µL细胞解离溶液，轻轻敲击混匀。然后于室温静置10分钟，以酶解法解离贴壁的结直肠癌类器官，具体操作如上文所述（步骤5.4）。
- 在1.5 mL微量离心管中，用500 µL含1% FCS的DMEM轻轻吹打细胞悬液数次，以大致解离细胞，操作如上所述（步骤5.5）。剧烈吹打结直肠癌类器官以获得单细胞会显著降低细胞活力。因此，在1.5 mL微量离心管中轻柔吹打，使细胞团块在细胞悬液中仍可被肉眼观察到即可。
- 将细胞悬液在1,400 × g离心3分钟，弃去上清液。
- 建立结直肠癌PDX自发转移小鼠模型：
- 制备含有 5 x 105 每只小鼠使用50 µL PBS悬浮细胞，其中含50%人工细胞外基质。使用前将悬浮液置于冰上保存。按照步骤3.3所述，使用血细胞计数板对癌细胞进行计数。
- 使用小动物吸入式麻醉装置通过异氟烷吸入麻醉小鼠，并用70%乙醇对皮肤进行消毒。确保呼吸频率和深度正常，且无趾夹反射，以确认麻醉效果充分。可在眼睛上涂抹兽医用眼膏，以防止麻醉期间角膜干燥。
- 将NOG小鼠仰卧置于实验台面上。用无菌镊子夹住直肠黏膜并轻轻将其拉出肛门。随后，立即使用注射器（针头规格：22 G）将步骤6.7.1中制备的细胞悬液注射至小鼠直肠黏膜下层。通常每组使用4–6只小鼠以评估实验结果。
