Измерение кальпаин деятельности в фиксированных и живых клеток методом проточной цитометрии

Summary

В этой статье мы подробно протокол для измерения кальпаин деятельность в фиксированных и живых клеток методом проточной цитометрии.

Abstract

Кальпаинов повсеместно внутриклеточный кальций-чувствительным, нейтральных протеаз цистеина

Protocol

Подготовка реагентов

Примечание: Все PBS содержит Са ^{2 +} и Mg ^{2 +}

1. Обнаружение реагент
   Добавить 20 мкм 7-амино-4-хлорметил кумарин, т-ВОС-лейцин-метионин амид (ВОС-LM-КЦР) до комнатной температуры PBS. Каждая ячейка подвески потребует 2 мл реагента обнаружения.
2. 1% Параформальдегид (Fixed клеток)
   Развести 4% раствора параформальдегида акции при комнатной температуре PBS. Алиготе 1 мл 1% параформальдегида в каждую пробирку СУИМ. Три FACS труб, необходимых для каждого экспериментальных условиях (например, 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 понадобится 9 FACS труб)
3. PD150606 (кальпаин ингибитор)
   Развести PD150606 в ДМСО в конечной концентрации 100 мм. Защитить этот реагент и все клетки, обработанные с ним от света на протяжении всего эксперимента.
4. PD98059 (MEK1 ингибитор)
   Развести PD98059 в ДМСО в конечной концентрации 50 мМ.

Подготовка клетки

1. Расти 32Dkit клеток на 5 х 10 ⁵ до 1 х 10 ^{6 клеток} на мл в Opti-MEM среде с 5% эмбриональной телячьей сыворотки, WEHI-3 супернатант в качестве источника ИЛ-3 (или любой другой источник для ИЛ-3 таких как рекомбинантный белок), 0,1% 2-меркаптоэтанола и антибиотики.
2. Соберите 12 х 10 ⁶ 32Dkit клетки на три 15 мл пробирки Сокол (4 х 10 ^{6 клеток} на трубку).
3. Гранул клеток при 1000 оборотов в минуту в течение 5 минут при 15 ° C.
4. Аспирируйте супернатант. Ресуспендируют клеток в 2 мл PBS комнатной температуре.
5. Лечить одну ячейку подвеска с 50 мкм PD150606. Обеспечить образец защищенном от света, покрывая трубки Сокол с алюминиевой фольгой. Vortex кратко, то инкубировать в течение двадцати до тридцати минут при комнатной температуре в темноте.
6. Лечить второй суспензии клеток с 20 мкм PD98059. Пластина клеток в 35-мм блюдо культуры тканей и инкубировать в течение 2 часов при температуре 37 ° C.

Кальпаин Пробирной в основной клетки

1. Хотя образцы инкубации с PD150606, начинают кальпаин анализа на необработанных образцах. Начните с добавлением 2 мл реагента обнаружения каждой клеточной суспензии. Сразу же добавить 1 мл клеточной суспензии / смесь реагент для обнаружения ранее подготовленный FACS труб с 1% параформальдегида (0 минут временной точке).
2. Инкубируйте клеточные суспензии с обнаружением реагента в течение 5 минут при комнатной температуре. Затем добавить 1 мл клеточной суспензии в трубке FACS с 1 мл 1% параформальдегида.
3. Продолжить инкубации суспензии клеток с обнаружением смеси для дополнительных 5 минут при комнатной температуре. Затем добавить 1 мл клеточной суспензии в трубке FACS с 1 мл 1% параформальдегида.
4. Повторите кальпаин анализа на 32Dkit клетки, которые были обработаны с ингибиторами.
5. Fix клетки на ночь в темноте при 4 ° C.
6. На следующий день гранулах клетки при 1800 оборотов в течение 5 минут при 15 ° C.
7. Аспирируйте супернатант. Ресуспендируют клеток в 750uL PBS. Место клетки на льду и держать в темноте.

Сбор данных для фиксированной клетки

1. Анализ клеток с использованием LSR II (BD Bioscience). Фильтры устанавливаются для Lightwave Xcyte (УФ) лазера, линии возбуждения 355nm и мощности лазера 25mW, выброс 405 и 450 нм для субстрата и продукта соответственно. Полосовой фильтр для субстрата и продукта 405/20 и 450/50. Длинные фильтрами для субстрата и продукта являются 405 и 450. Напряжения ФЭУ был установлен на 350-375 для подложки и 325-350 для продукта.
2. Настройка эксперимента BD FACSDiva со следующими параметрами: прямое рассеяние; стороны разброс; индо-1 Blue (журнал); индо-1 фиолетовый (журнал). На листе созданы следующие графы: вперед по сравнению с разбросом стороны разброс точка участка с ворот на живые клетки (рис. 1а), индо-1 Синяя гистограммы, индо-1 Фиолетовый гистограммы, индо-1 Синяя против индо-1 Фиолетовый точкой сюжета.
3. Калибровка ЛСР II с AlignFlow и AlignFlow плюс флуоресцентные шарики (Invitrogen). Напряжения ФЭУ должен быть отрегулирован на пике бусинка флуоресценции гистограммы в том же самом канале перед каждым экспериментом.
4. Начните приобретения данных с использованием 32Dkit клеток в 0 момент времени минуте. Настройка параметров напряжения по мере необходимости. Приобретение и записи 10000 событий в образце.
5. Повторите приобретение для каждого образца, полоскания машина с FACS буфером между каждую пробирку.
6. Экспорт данных. Обеспечить ЛСР II очищается в соответствии с руководящими принципами института.

Кальпаин Пробирной в живых клетках

1. Подготовка клеточные суспензии, как и раньше, без каких-либо PD150606. Принесите образцы ЛСР II и настроить фильтры и параметры, как указано выше. Настройка листа как указано выше. Включите большой участок точка показывает индо-1 Синяя зависимости от времени. Установите программу приобрести максимальное количество цилиндровBER событий (без стоп-ворота).
2. Добавить 50 мкм PD150606 одной клеточной суспензии из 32Dkit клеток. Держите образца в темноте и инкубировать при комнатной температуре в течение 20-30 минут.
3. Начните, собирающих данные о 32Dkit суспензии клеток, не PD150606. Используйте низкий расход 200-300 событий в секунду. По истечении 30 секунд до 1 минуты удалить трубку из машины. Добавить 20 мкм ВОС-LM-CMAC к клеткам. Vortex кратко затем продолжить приобретение данных.
4. Приобретать данных в течение 10-20 минут или до плато деятельности кальпаин.
5. Повторите шаги 3 и 4 с 32Dkit клетках, обработанных PD150606.
6. Экспорт данных. Обеспечить ЛСР II очищается в соответствии с руководящими принципами института.

Кальпаин Пробирной в сложных (смешанных) клеточных популяций

* Этот эксперимент будет определять 32Dkit клеток в суспензии клеток найденным мыши селезенки.

1. Урожай селезенки от каждой мыши. Lyse эритроцитов с NH ₄ Cl в течение 10 минут при комнатной температуре.
2. Подготовка одного клеточные суспензии в 2 мл PBS.
3. Разделить каждую клеточную суспензию на две части. Лечить 1 клеточной суспензии с 50 мкм PD150606 в течение 20-30 минут при комнатной температуре в темноте.
4. Выполните выше кальпаин Пробирной в основной клетки (шаги 1-6)
5. Аспирируйте супернатант. Вымойте клеток в 500 мкл PBS. Аспирируйте супернатант.
6. Ресуспендируют клеток в 200 мкл буфера окрашивания 2% BSA. Инкубировать 15 минут при комнатной температуре.
7. Подготовка первичных антител (FITC анти-CD117 мыши). Антитела должны быть использованы в разведении 1:200 в окрашивании буфера. Обеспечить антител остается в темноте.
8. Добавить 200 мкл первичных антител к клеткам. Инкубировать 30 минут при комнатной температуре в темноте.
9. Добавить 400μL PBS увеличить объем для проточной цитометрии. Место клетки на льду и держать в темноте.
10. Следуйте указаниям на сбор данных для фиксированной ячейки. Добавить FITC к параметрам и включают в себя гистограмму для FITC на листе.

Анализ и представитель Результаты

1. Анализ данных с помощью FlowJo (Treestar). Ворота на живые клетки на основе прямой и боковой разброс профиля (рис. 1а). Определить среднюю флуоресценции для индо-синий с жизнеспособной ворота ячейки (рис. 1b).
2. а) При смешанной популяцией клеток
   • использование FITC флуоресценции от гистограмм и точка участков для выявления 32Dkit населения
   • Определить среднюю флуоресценции для индо-Синий 32Dkit населения
3. Использование Microsoft Excel в графе означает флуоресценции (рис. 2а). Рассчитать наклон линии от 5 до 10 минут. График склоне в виде гистограммы, чтобы определить кальпаин активности клеток (рис. 2б).

На рисунке 1а. Определение живых клеток на основе прямой и боковой разброс профиля.

На рисунке 1б. Среднее флуоресценции меняться с течением времени курс 10 минуты.

На рисунке 2а. Представителю график означает флуоресценции.

На рисунке 2б. Кальпаин деятельности в 32Dkit клеток с ингибиторами.

Discussion

Деятельности кальпаин в фиксированных и живых клеток 32Dkit была определена в этом видео протокол. Лечение линию клеток с ингибитором кальпаин PD150606 привело к полному торможению кальпаин активности в клетках. Кроме того, лечение ингибиторами MEK1 PD98059 привело к полному торможению кальпаин активности в клетках. ERK является основным активатором кальпаин-2 ^3. Эти результаты показывают, что кальпаин-2 активности преобладает в 32Dkit клеток. Текущая работа в нашей лаборатории изучает последствия повышения активности кальпаин и вклад кальпаин-1 и калпаина-2 в лейкемией.

Это детали протокола первого проточной цитометрии основан анализа для измерения кальпаин уровней активности в фиксированных и живых клеток и может быть использован, чтобы понять механизм кальпаин регулирование и его роль в патологических процессов с использованием интактных клеток.

Этот протокол может быть изменен, чтобы изучить эффекты ингибиторов или генных манипуляций на деятельность кальпаин. Кроме того, этот анализ может быть использован для измерения кальпаин деятельности в сложную смесь клеток, таких как пуповинной крови или для выявления и измерения кальпаин активности в клеточных подмножеств изолированы от селезенки.

Этот анализ не делает различия между активностью образующихся в различных изоформ кальпаин. Генетические или фармакологических реагентов, сбить с ног или препятствовать конкретных кальпаинов может быть использована для решения этого вопроса.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde	Invitrogen		Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C
PD150606	Invitrogen		Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition.
PD98059	Cell Signaling Technology
AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes	Invitrogen
LSR II	BD Biosciences		Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth.