转基因线虫在秀丽隐杆线虫（C. elegans）研究中被广泛使用。本文描述了一种简单而有效的方法，利用包裹DNA的金颗粒进行基因枪轰击，将外源基因导入线虫。该方法在操作难度和实验结果方面均能与显微注射法在转基因动物制备中的效果相媲美。
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摘要
摘要
使用自由生活的线虫 C. elegans 的实验室数量正在迅速增长。这种生物模型的流行归因于其世代周期短、寿命短、易于且低成本的培养、基因组已完全测序，以及丰富的RNAi资源和突变体动物。此外，对 C. elegans 基因组的分析揭示了线虫与高等脊椎动物之间存在高度相似性，这表明在线虫中开展的研究可能对整体小鼠或培养细胞中的研究具有重要的补充作用。线虫研究中一个强大而重要的部分是利用转基因动物研究基因的定位与功能。转基因动物可通过显微注射至线虫生殖系，或通过基因枪轰击法（biolistic bombardment）构建。轰击法是一种较新的技术，许多实验室对其尚不熟悉。本文描述了一种使用Bio-Rad PDS-1000系统，通过金颗粒基因枪轰击法生成转基因线虫的简单实验方案。与将DNA显微注射入雌雄同体生殖系的方法相比，该方案的优势在于无需操作者具备识别线虫解剖结构或执行显微注射的特殊技能。此外，单次轰击通常可获得多个转基因品系。与显微注射不同的是，基因枪轰击法可产生同时携带附加体阵列和整合型外源基因的转基因动物。获得整合型转基因品系的能力可避免使用诱变方法来整合外源DNA。总之，基因枪轰击法是一种构建转基因动物的有吸引力的方法，尤其适用于那些不愿投入时间和精力掌握显微注射技术的研究人员。
方案
概述
传统上，转基因线虫是通过将转基因DNA显微注射到C. elegans的生殖系中而产生的1,2,3,4。尽管该方法可行，但需要专门的设备以及对线虫解剖结构和显微注射技术的熟练掌握。近年来，基因枪轰击法被开发为一种替代方法，该方法利用DNA包被的金颗粒将外源DNA导入生殖系5,6。该方法在成功操作前所需的技术练习时间较短。
利用基因枪轰击 C. elegans 以产生转基因线虫在单个线虫水平上的效率较低，因此成功转化需要大量动物。这些线虫可通过多种方式培养，但我们采用卵板培养法以减少工作量和所需培养板的数量。本实验方案首先介绍卵板和线虫的制备，然后重点描述使用 Bio-Rad PDS-1000/He Hepta 系统进行轰击的实验步骤。本方案部分借鉴了 Berezikov 等人7的工作。
通过基因枪轰击法转化时，通常使用 unc-119 基因作为转基因动物的筛选标记。携带该突变的线虫品系运动严重失调，几乎无法移动，体型短粗，且不能形成耐久型幼虫（dauer larvae）8。耐久型幼虫是一种可替代的幼虫发育阶段，用于在不利环境条件下延迟发育至生殖成熟成虫，而进入耐久型幼虫阶段受多个基因调控9。....
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讨论
基因枪轰击是一种将外源DNA导入多种生物体（包括C. elegans）的简单方法1,5,6,7,16。该方法依赖于DNA在CaCl2存在下与金颗粒形成复合物。阳离子型多胺（如亚精胺）可在体内保护DNA免受核酸酶降解。由于亚精胺是一种不稳定的分子，因此应将其分装后于-20°C保存，并在进行轰击前新鲜配制溶液。如我们在轰击实验方案中所述，可用鱼精蛋白替代亚精胺以递送外源DNA15。鱼精蛋白的优势在于其在室温下更稳定，且为粉末状而非黏稠液体。
可以将 unc-119 救援基因置于与转基因相同的质粒上（顺式），或置于另一质粒上，在包被金颗粒前与转基因质粒混合。尽管混合一个或多个质粒通常能够成功，但我们及其他研究者发现，用多种质粒轰击线虫可能导致产生的转基因动物仅携带部分而非全部质粒6,11。为了便于将 unc-119 基因插入转基因质粒中，我们近期描述了一种利用同源重组将 unc-119 基因插入几乎所有质粒的氨苄青霉素抗性基因中.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究获得了匹兹堡大学的种子基金以及美国国立卫生研究院（NIH）授予 A.L.F. 的 AG028977 项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 金颗粒 | Inbio gold | BD021 | 1微米 |
| 中量质粒提取试剂盒 | Qiagen | 12143 | |
| 亚精胺 | Sigma-Aldrich | S4139 | |
| 鱼精蛋白 | Sigma-Aldrich | P4505 | |
| 宏载体 | Bio-Rad | 165-2335 | |
| PDS-1000/He Hepta 系统 | Bio-Rad | 165-2257 | |
| 破裂盘 | Bio-Rad | 165-2330 | |
| 制霉菌素 | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| 链霉素 | MP Biomedicals | 100556 |
参考文献
- Evans, T. C. Wormbook. , 1-15 (2006).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA tr....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation
Posted by JoVE Editors on 12/12/2012. Citeable Link.
The volume for a solution in, Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation, was incorrect.
