通过基因枪转化法产生转基因 C. elegans

摘要

转基因线虫在秀丽隐杆线虫（C. elegans）研究中被广泛使用。本文描述了一种简单而有效的方法，利用包裹DNA的金颗粒进行基因枪轰击，将外源基因导入线虫。该方法在操作难度和实验结果方面均能与显微注射法在转基因动物制备中的效果相媲美。

摘要

使用自由生活的线虫 C. elegans 的实验室数量正在迅速增长。这种生物模型的流行归因于其世代周期短、寿命短、易于且低成本的培养、基因组已完全测序，以及丰富的RNAi资源和突变体动物。此外，对 C. elegans 基因组的分析揭示了线虫与高等脊椎动物之间存在高度相似性，这表明在线虫中开展的研究可能对整体小鼠或培养细胞中的研究具有重要的补充作用。线虫研究中一个强大而重要的部分是利用转基因动物研究基因的定位与功能。转基因动物可通过显微注射至线虫生殖系，或通过基因枪轰击法（biolistic bombardment）构建。轰击法是一种较新的技术，许多实验室对其尚不熟悉。本文描述了一种使用Bio-Rad PDS-1000系统，通过金颗粒基因枪轰击法生成转基因线虫的简单实验方案。与将DNA显微注射入雌雄同体生殖系的方法相比，该方案的优势在于无需操作者具备识别线虫解剖结构或执行显微注射的特殊技能。此外，单次轰击通常可获得多个转基因品系。与显微注射不同的是，基因枪轰击法可产生同时携带附加体阵列和整合型外源基因的转基因动物。获得整合型转基因品系的能力可避免使用诱变方法来整合外源DNA。总之，基因枪轰击法是一种构建转基因动物的有吸引力的方法，尤其适用于那些不愿投入时间和精力掌握显微注射技术的研究人员。

方案

概述

传统上，转基因线虫是通过将转基因DNA显微注射到C. elegans的生殖系中而产生的^1,2,3,4。尽管该方法可行，但需要专门的设备以及对线虫解剖结构和显微注射技术的熟练掌握。近年来，基因枪轰击法被开发为一种替代方法，该方法利用DNA包被的金颗粒将外源DNA导入生殖系^5,6。该方法在成功操作前所需的技术练习时间较短。

利用基因枪轰击 C. elegans 以产生转基因线虫在单个线虫水平上的效率较低，因此成功转化需要大量动物。这些线虫可通过多种方式培养，但我们采用卵板培养法以减少工作量和所需培养板的数量。本实验方案首先介绍卵板和线虫的制备，然后重点描述使用 Bio-Rad PDS-1000/He Hepta 系统进行轰击的实验步骤。本方案部分借鉴了 Berezikov 等人⁷的工作。

通过基因枪轰击法转化时，通常使用 unc-119 基因作为转基因动物的筛选标记。携带该突变的线虫品系运动严重失调，几乎无法移动，体型短粗，且不能形成耐久型幼虫（dauer larvae）⁸。耐久型幼虫是一种可替代的幼虫发育阶段，用于在不利环境条件下延迟发育至生殖成熟成虫，而进入耐久型幼虫阶段受多个基因调控⁹。C. elegans 遗传学中心（CGC，明尼苏达州明尼阿波利斯）提供多种携带 unc-119 突变的品系。原始的 DP38 品系（unc-119(ed3)）还携带一个无关的耐久型幼虫组成型（daf-c）突变，可能会影响后续实验。多个实验室已对该突变进行了回交清除，HT1593 品系可从 CGC 获得。我们发现使用 DP38 品系更容易识别转基因个体，因此倾向于使用该品系来制备转基因线虫。必要时，我们会利用 HT1593 品系对转基因线虫进行回交，以去除 daf-c 突变。使 DP38 线虫正常生长是本实验流程中最耗时的步骤之一，因此我们在构建转基因载体的同时会持续维持若干培养板的线虫培养。

共表达unc-119标记基因与目的基因，可根据线虫正常运动能力及体型的恢复情况，简便地鉴定出携带转基因的个体⁵。unc-119基因可从多个来源获得，目前已使用包含unc-119基因组DNA、unc-119启动子与cDNA，以及较小的C. briggsae基因组DNA的载体^8,10。我们近期报道了一种简单的方法，可通过同源重组将unc-119表达盒插入任何含有氨苄青霉素抗性基因的质粒中¹¹，以及一种利用Cre-lox重组技术对线虫fosmid文库进行改造，使其携带unc-119基因以生成转基因个体的方法¹²。相关质粒可从Addgene公司（美国马萨诸塞州剑桥市）获取。

尽管进行一次基因枪轰击所需的工作量较大，但尚可管理；而在同一天内进行多次轰击所增加的工作量却极为有限。因此，我们通常将转基因线虫的制备集中进行，以降低每批次的制备工作量。

1. 蛋白质凝胶制备

unc-119 突变型线虫在标准NGM平板上难以培养，因为其运动能力受损，容易停留在平板的某些区域而无法移动到仍有食物的其他区域，从而导致饥饿死亡。卵板可解决这一问题，因为卵板上的食物层较厚，使unc-119线虫更容易爬行并扩散至整个平板表面⁷。此外，卵板还能支持大量线虫的生长，因此所需平板数量更少¹³。通常，5个卵板足以培养一次基因枪轰击所需的线虫。以下配方可制备约50个平板，但可根据需要减半以制备更少数量。

卵板容易受到污染，因此我们在卵板中同时使用抗生素和抗真菌药物，并且仅使用经次氯酸盐处理获得的卵来接种卵板。

第1天：

1. 在500 mL瓶中制备LB培养基（400 mL），121°C高压灭菌20分钟。
2. 使用1升含2%琼脂的NGA培养基，倾注约50个直径10 cm的NGA平板。每升培养基中加入10 mL制霉菌素和链霉素至终浓度200 μg/mL¹³。
3. 在含200 μg/mL链霉素的LB培养基中培养40 mL OP50-1菌液，过夜培养。该菌株具有链霉素抗性，可从CGC获取。
4. 将一个500 mL瓶高压灭菌，留作次日使用。

第2天：

1. 将10个鸡卵的卵黄用蛋黄分离器（可在家居用品商店如Target购买）分离至无菌瓶中。振荡混匀。
2. 用LB培养基定容至400 mL。振荡混匀。
3. 在60°C下孵育1小时。
4. 冷却至室温。
5. 加入40 mL OP50-1。振荡混匀。
6. 每块培养皿中分装5–8 mL混合液。
7. 让培养皿在室温下静置过夜。

第3天：

1. 轻轻倒掉培养皿中剩余的液体。盖上皿盖，在室温下静置过夜晾干。

第4天：

1. 将培养皿放入盒子或塑料袋中，并在4°C下保存至需要时使用。这些培养皿似乎在1-2个月内使用均无问题。

2. 接种卵板

1. 通过向近期饥饿的平板中添加浓缩的OP50，在6 cm NGA平板上扩增DP38线虫。对于单次轰击，我们使用约6个小型平板来接种5个产卵平板。对于多次轰击，我们先用这些小型平板接种2个富含肽胨的平板，再用其接种产卵平板。
2. 利用次氯酸盐从DP38线虫中分离卵^13,14。将卵重悬于无菌S-basal或M9缓冲液中^13,14。
3. 将卵（>每板10,000个以上）接种至相应数量的产卵平板上。将线虫在20°C下于产卵平板中培养7–10天，用于后续轰击。当线虫开始清除平板上的食物时，平板即已准备就绪。这些平板极难饥饿化，延长培养时间可提高线虫产量。

轰击

我们预先配制好金标准品，并将其储存在4°C以备使用。还需要准备未点种和已点种的10 cm NGA平板。未点种的平板需提前倾注，并充分干燥，以便更好地吸收后续加入的液体和线虫。

在轰击当天，我们首先将线虫清洗干净，然后开始制备DNA包被的金颗粒。接着，将线虫加入未点样的NGA平板中，并完成金颗粒的洗涤，将其转移至宏载体上。

金颗粒制备：

1. 称取60mg金颗粒置于1.7mL离心管中，加入70%乙醇浸泡15分钟。短暂离心，使金颗粒沉淀。
2. 用无菌水洗涤3次，每次短暂离心以收集金颗粒。
3. 将金颗粒重悬于1mL 50%无菌甘油中。此为储备金颗粒溶液，可在4°C保存数月。

线虫：

1. 用 S-basal 或 M9 缓冲液将 DP38 线虫从卵板上漂洗下来，并转移至 50 mL 锥形管中。
2. 将锥形管静置于实验台，待线虫沉降至管底后，吸除上清缓冲液，加入新鲜的 S-basal 或 M9 缓冲液。重复洗涤 2 至 3 次，直至缓冲液中无明显碎片。在此步骤中保持线虫状态，直至完成 DNA 包被。
3. 吸除缓冲液，每轮轰击保留约 2–3 mL 含线虫的缓冲液。将线虫转移至冰上预冷的 10 cm 未涂菌 NGA 平板。应尽量减少转移体积，因为 NGA 平板在轰击前必须完全干燥。确保线虫均匀覆盖平板整个表面。
4. 将平板置于冰上晾干。冰浴可防止线虫在干燥过程中聚集。

此步骤非常重要：培养皿应保持干燥，且线虫需均匀分散在NGA平板上。将线虫置于冰上可防止其在平板上移动并聚集成堆。

DNA 制备（一次轰击用）：

1. 在1.7 mL离心管中混合：
   • 50 μl 金颗粒。加入前需充分重悬。
   • 50 μl DNA（10–15 μg）。环状或线性DNA之间差异不大。通常使用Qiagen中量制备柱进行DNA纯化（Qiagen Inc.，Valencia，CA）。
   • 50 μl 2.5 M CaCl₂。该溶液在室温下可稳定数周。
   • 20 μl 0.1 M 亚精胺。
     
     亚精胺在水溶液中不稳定。我们将亚精胺分装为16 μl每份，储存于-20°C。使用前加入1 mL水，配制成0.1 M溶液。每次轰击前必须新鲜配制该溶液。
     
     通常在1.7 mL离心管中以低速涡旋金颗粒，同时在涡旋过程中逐滴加入CaCl₂、DNA以及亚精胺/鱼精蛋白。对于曾使用磷酸钙法转染的研究者而言，该技术较为熟悉。
     
     我们亦曾以鱼精蛋白替代亚精胺，获得极佳效果¹⁵。将鱼精蛋白新鲜配制成水溶液（1 mg/mL），使用50 μl替代20 μl亚精胺。若使用鱼精蛋白，通常在室温孵育混合物10分钟，而非置于冰上。鱼精蛋白无需冷冻保存，呈粉末状而非液体。
2. 将混合物置于冰上孵育30分钟，并定期混匀以保持金颗粒悬浮。短暂离心后吸除上清液。
3. 用300 μl 70%乙醇洗涤，短暂离心。
4. 用1 mL 100%乙醇洗涤，短暂离心。
5. 用170 μl 100%乙醇重悬。

宏载体的制备：

1. 用2-丙醇冲洗7个宏载体（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）。将它们置于纸巾上，在室温下晾干。
2. 在每个宏载体的中心加入20μl DNA/金混合物。加样前务必充分涡旋振荡，以保持金颗粒处于悬浮状态。
3. 让乙醇自然蒸发。

3. 轰击

实验前务必进行一次空白轰击，以使氦气通过系统进行冲洗。

1. 打开真空泵并关闭真空泵捕集阱。我们使用无油真空泵。
2. 打开氦气罐，检查压力是否 ≥2200 psi。
3. 将破裂盘（1350 psi）用2-丙醇润湿，并放入七通适配器的固定帽中。
4. 将适配器旋入PDS-1000系统，并使用配套的扭矩扳手拧紧。
5. 将7个宏载体放入载体 holder 中，并使用配套工具将其固定。然后将七通挡板和底板装到 holder 上。将 holder 翻转，放置在从上数第二层架子上。此时，宏载体的金粉面必须朝下。
6. 将宏载体 holder 顶部的孔与七通适配器的出口对齐。
7. 将涂有线虫的NGA平板（打开盖子）放置在轰击室最底层的架子上。
8. 完全打开PDS-1000上的真空流速旋钮。按下“vac”按钮，直至轰击室内压力达到26英寸汞柱（In Hg），然后切换至“hold”位置以维持真空状态。
9. 按下并按住“fire”按钮，直至破裂盘破裂。当压力达到1350 psi时，破裂盘将破裂。此过程有时需要5–20秒。随后松开按钮。
10. 释放轰击室内的真空（切换至“vent”位置），并取出平板。
11. 关闭真空泵和氦气罐。
12. 多次点火，直至管路中不再含有氦气（氦气压力表应显示为0 psi）。
13. 关闭PDS-1000系统。

轰击后线虫的回收：

1. 将轰击后的平板置于20°C下静置20分钟。
2. 用10 mL S-基础培养液或M9缓冲液将线虫从平板上冲洗下来。
3. 将0.5 mL线虫转移至20个10 cm已涂布NGA平板上。
4. 在20°C或室温（22–24°C）下培养约2周，然后检查是否有表型恢复的线虫。
5. 使用解剖显微镜筛选具有unc-119(+)表型的线虫。最佳筛选时机是在平板上的食物耗尽后，因为恢复的线虫相较于未恢复的线虫具有生存优势。
6. 从每个含有表型恢复线虫的10 cm平板中分别建立一个独立品系。

4. 代表性结果

该方案在获得转基因动物方面的成功率取决于特定的转基因元件。对于启动子:GFP 报告基因转基因，我们已获得多达20个品系，更典型的结果是获得3-10个品系。最多有30%的转基因品系为整合型品系，但整合事件具有随机性，因此若特别需要获得整合型品系，我们将在同一天内进行多次基因枪轰击实验。

讨论

基因枪轰击是一种将外源DNA导入多种生物体（包括C. elegans）的简单方法^1,5,6,7,16。该方法依赖于DNA在CaCl₂存在下与金颗粒形成复合物。阳离子型多胺（如亚精胺）可在体内保护DNA免受核酸酶降解。由于亚精胺是一种不稳定的分子，因此应将其分装后于-20°C保存，并在进行轰击前新鲜配制溶液。如我们在轰击实验方案中所述，可用鱼精蛋白替代亚精胺以递送外源DNA¹⁵。鱼精蛋白的优势在于其在室温下更稳定，且为粉末状而非黏稠液体。

可以将 unc-119 救援基因置于与转基因相同的质粒上（顺式），或置于另一质粒上，在包被金颗粒前与转基因质粒混合。尽管混合一个或多个质粒通常能够成功，但我们及其他研究者发现，用多种质粒轰击线虫可能导致产生的转基因动物仅携带部分而非全部质粒^6,11。为了便于将 unc-119 基因插入转基因质粒中，我们近期描述了一种利用同源重组将 unc-119 基因插入几乎所有质粒的氨苄青霉素抗性基因中...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
金颗粒	Inbio gold	BD021	1微米
中量质粒提取试剂盒	Qiagen	12143
亚精胺	Sigma-Aldrich	S4139
鱼精蛋白	Sigma-Aldrich	P4505
宏载体	Bio-Rad	165-2335
PDS-1000/He Hepta 系统	Bio-Rad	165-2257
破裂盘	Bio-Rad	165-2330
制霉菌素	Sigma-Aldrich	N1638
链霉素	MP Biomedicals	100556