成年斑马鱼腹腔注射

摘要

我们演示了对成年斑马鱼进行腹腔注射的方法。我们使用由Micro4控制器和UltraMicroPump III驱动的10 μl NanoFil微量注射器。本实验示范中采用冷水作为麻醉剂。

摘要

对斑马鱼进行化学处理的一种便捷方法是将试剂加入鱼缸水中，使其被鱼类吸收。然而，这种方法难以确定每条鱼吸收或摄取的试剂具体量。某些实验问题，特别是与代谢研究相关的问题，可能更适合根据鱼的体重向每条鱼给予明确定义的剂量。本文介绍一种对成年斑马鱼进行腹腔内（IP）注射的方法。注射部位位于腹部腔内，位于骨盆带后方。该方法借鉴了用于较大鱼类的兽医技术。该方法安全性高，我们观察到无任何死亡情况。此外，在127次注射中，仅5次出现注射部位出血，且每次出血时间短暂，持续数秒，失血量极少。成功实施该操作需要在多个步骤中轻柔地处理鱼类，包括禁食、称重、麻醉、注射和恢复。整个过程中需采取预防措施以尽量减少鱼类应激。我们的预防措施包括使用小体积注射和35G针头。我们采用Cortland盐溶液作为溶剂，该溶液对淡水鱼具有渗透压平衡作用。在注射过程中，通过以下两种方式维持鳃部通气：首先将鱼麻醉至外科手术水平，以保持鳃盖缓慢运动；其次，在注射期间将鱼置于水饱和海绵内的凹槽中固定。我们通过注射葡萄糖并监测血糖水平的升高及其随后恢复正常的过程，展示了腹腔内注射的应用价值。由于已知应激会升高硬骨鱼类的血糖水平，我们比较了溶剂注射组与未注射成年鱼的血糖水平，结果表明该操作不会引起血糖水平的显著升高。

方案

1. 注射前准备

1. 在注射前至少禁食鱼类24小时，以排空肠囊（胃）内容物。基本的禁食方案是将鱼以正常密度转移至一个干净的水族箱中，然后停止喂食。对于需要更严格条件的长期禁食（例如用于血糖研究），请参见讨论部分的额外注意事项。
2. 配制Cortland盐溶液（Perry et al., 1984）。
   配制100 mL溶液时，将以下成分溶解于蒸馏水中：
   725 mg NaCl (124.1 mM)
   38 mg KCl (5.1 mM)
   41 mg Na₂HPO₄ (2.9 mM)
   24 mg MgSO₄∙7H₂O (1.9 mM)
   16 mg CaCl₂∙2H₂O (1.4 mM)
   100 mg NaHCO₃ (11.9 mM)
   4 g 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）(4%)
   1,000 USP单位肝素（Heparin）
   过滤、灭菌后于4°C保存。
3. 准备显微镜。
   • 在显微镜底座上覆盖塑料薄膜，以防液体溢出造成损坏。
   • 在塑料薄膜上铺一张纸巾，手术台将放置在纸巾上方。
   • 通过观察手术台并对海绵进行调焦，预先调整好焦距。
   提示：将手指放在海绵上方并对准手指调焦，这样在将鱼放置到手术台上后，可避免或尽量减少进一步的调焦操作。
4. 称量鱼类。
   • 取一个500 mL烧杯，加入约1/3体积的养殖系统用水。
   • 将天平归零。
   • 使用渔网捕获鱼类，并用纸巾轻轻蘸去渔网和鱼体表面多余的水分。将鱼转移至烧杯中。
   • 称量鱼的重量。
   • 将鱼转移至一个干净的水族箱中。
   • 将每条已称重的鱼分别转移至各自标记好的水族箱中。
   • 根据每条鱼的体重计算注射体积。
5. 准备注射器及相关注射设备。推荐使用35G斜面钢针和10 μL NanoFil微量注射器进行注射。按照制造商说明准备NanoFil注射器和Silflex连接管。务必彻底排除注射器和管路中的所有气泡。在填充注射器和管路后，将注射器安装到注射泵上，并为第一条鱼设定注射体积程序。
6. 准备手术台。
   • 将一块软质海绵（例如#L800-D，Jaece Industries）切割至高度约为20 mm。在平整的表面切出一条深10–15 mm的切口，该切口即为用于固定鱼类以进行注射的凹槽。
   • 将海绵放入一个60 mm的培养皿中。
   • 将装有海绵的培养皿置于一个大小合适的移液器吸头盒盖中。该盖子应足够大以容纳适量水以维持海绵温度，但又足够浅以避免妨碍操作。我们使用的是P200吸头盒的盖子，尺寸为11.4 cm长 × 7.7 cm宽 × 1.5 cm深。
   上述三部分组合在一起（海绵置于培养皿中，再放入盒盖内）即构成手术台。
7. 准备麻醉剂。
   • 使用由养殖系统用水制成的冰块制备碎冰。
   提示：使用标准冰格制冰时，麻醉10–12条鱼大约需要3盘冰块。
   • 将碎冰装入一个干净的冰桶中。
   • 将手术台放入一个较大的容器中，例如2.4升的Rubbermaid食品储存盒。
   • 向外层容器及手术台中倒入一些温热的养殖用水。在附近保留一定量的温热养殖用水备用。
   • 将一支温度计插入外层容器中。

2. 麻醉、注射与恢复

1. 将麻醉用外容器连同手术台放置在显微镜旁边，并在附近准备好装有冰屑的桶。
2. 通过添加冰屑将水温降至17°C。重要提示：此步骤中水温不得低于17°C。
3. 使用渔网将鱼转移到外容器中。
4. 在数分钟内缓慢向容器中添加冰屑，使水温逐渐降至12°C。
5. 观察鱼的行为变化：当水温达到17°C或略低时，鱼通常会将胸鳍水平展开，出现喘气现象，并伴有快速的鳃盖运动。随着温度下降，鱼的游动速度逐渐减慢，最终停止游动。当接近手术麻醉深度时，喘气停止，鳃盖运动明显变慢。当鱼在被操作时无任何反应，即表示已准备好进行注射。对大多数鱼而言，12°C已足够；较大的鱼可能需要更低的水温。
6. 当达到所需温度（约12°C或更低）时，按压海绵使其充分吸水饱和。
7. 操作时手指应充分浸于冷水中，以避免手指温度升高而使鱼体升温，导致其在操作过程中脱离麻醉状态。
8. 用冰冷的手指轻轻将鱼转移至海绵的凹槽中，使鱼腹部朝上，鳃部位于凹槽内。
9. 迅速将手术台转移至显微镜载物台上。
10. 操作需迅速而谨慎：将针头插入腹鳍之间的中线位置，针尖朝向头部方向，进针点应更靠近盆骨而非肛门。当针头穿过体壁进入体腔时，应能感觉到落空感。注入适当体积的药液后，缓慢拔出针头。
11. 注射完成后，立即将鱼从海绵上松开，放回约28.5°C的温水养殖缸中恢复。
    提示：若鱼未立即开始游动，可通过轻轻搅动水流冲向其鳃部，帮助其恢复呼吸。
12. 检查针头：有时鱼鳞可能附着在针头上，应在下一次注射前清除。
13. 对于后续的注射操作，在放入下一条鱼之前，应使用实验室温水将麻醉容器中的水温回升至17°C。

3. 代表性结果：

图1. 腹腔注射0.5 mg/g葡萄糖或溶剂后的代表性结果。注射前，斑马鱼禁食72小时。x轴显示注射后的时间。数据以均值±标准误表示。

讨论

腹腔注射包括五个步骤：禁食、称重、麻醉、注射和恢复。每个步骤都有相应的最佳操作规范，以确保实验成功。成功包括保证鱼类受试对象的健康以及获得良好的实验结果。

禁食：24 小时禁食应可排空肠道盲囊。该操作方法源自鱼类兽医学文献（例如 Brown 1993）。下文将进一步讨论其他禁食注意事项。

长期禁食：我们发现，在注射前需进行 72 小时禁食，以使血糖降至基础水平（Eames et al., 2010）。此外，我们还发现，在进行葡萄糖相关研究时，必须采取若干步骤以确保斑马鱼得到充分禁食。首先使用清洁的鱼缸（底部无残渣）。鱼缸应脱离常规饲养系统，明确标记为“禁食”，并放置在不会被热心的饲养人员误喂的位置。需评估鱼缸的外部环境，并采取措施避免外界干扰引起鱼类应激，因为已知应激会升高血糖水平（Chavin 和 Young，1970；Groff et al., 1999）。例如，我们曾在一个禁食实验中，每日在放置鱼缸的工作台上开启收音机，结果发现鱼的血糖异常升高，推断是由于振动导致鱼类应激。另一个应激源是过度拥挤。鱼类的饲养密度应符合良好的养殖规范。具体建议可参考 Brand et al.（2002）和 Westerfield（1995）。我们在 9 升鱼缸中以每缸 10–12 条鱼的密度进行禁食，效果良好（鱼缸中放置三层玻璃珠，占据部分体积）。在禁食期间，分隔性别可能引起应激，因此我们建议保持雌雄混合群体。这意味着可能会产卵，因此需要将卵隔离以防止被成鱼摄食。一种简单的隔离方法是在鱼缸底部铺设 2–3 层玻璃珠。需通过每日移除卵和排泄物，并更换约 10–15% 的水体，以维持水质。移除卵和废物时，虹吸法效果良好。

称重： 在称量未麻醉的鱼类时，应注意尽量减少从网中带入烧杯的水分，以确保称重准确。如果将装有鱼的网在纸巾上轻轻吸干，便可去除大部分多余的水分，从而准确测量重量。在称重前对鱼类进行麻醉可能更为方便，但我们尚未测试同一天内对鱼类进行两次麻醉可能产生的影响。我们通过先使用捞网/吸干法称量鱼类，再在麻醉后轻轻吸干并重新称量的方法来验证本技术的可靠性。结果显示，两种方法之间的重量差异无统计学意义（P = 0.7927，t检验）。此外，我们还测试了该捞网/吸干转移方法是否会影响血液葡萄糖水平，并与捞起后立即转移至烧杯（不吸干）的方法进行了比较。结果表明，两种转移方式对血糖水平的影响差异亦无统计学意义（P = 0.2241，t检验）。

麻醉： 化学麻醉可能适用于许多研究。本文中我们展示了冷水麻醉作为一种替代方法，因为许多麻醉剂（包括三卡因/MS-222（Brown，1993））会升高血糖。在之前的研究中，我们已确定冷水不会升高斑马鱼的血糖水平（Eames et al., 2010）。
进行冷水麻醉时，温度应缓慢降低。降温速率似乎取决于鱼的大小，体型较小的鱼比大鱼更快进入麻醉状态。注射后，您可能会观察到鱼从麻醉中恢复过慢（见下文）。这种情况可能由起始水温过低或降温过快引起。若鱼一进入水中即出现侧向弯曲，则表明起始温度过低。若起始温度合适，鱼最初会保持平衡，其胸鳍将转至水平位置，出现喘气动作，并伴有快速的鳃盖运动，通常还会尝试游动。随着温度下降，其活动逐渐减少，最终失去平衡。当鱼在操作时无反应，即达到外科手术所需的麻醉深度。为维持手术麻醉状态，操作者的手指必须保持低温，因此在接触鱼之前应先将手指浸入冷水中。用于支撑鱼的海绵也必须与麻醉用水保持相同低温。至关重要的是，应使用足够冷的水充分浸润海绵，以确保鱼放置其上后仍能维持麻醉状态。

注射： 在进行注射前，建议至少解剖一条鱼，以了解其体壁的厚度。这有助于判断针头需要刺入多深才能进入腹腔。此外，在插入针头时，当针头进入腹腔时，可以感觉到体壁的“突破感”。在注射过程中，应采取措施确保受试鱼处于良好状态。确保海绵充分浸透适宜温度的冷水，以防止鱼类在注射过程中苏醒。充分浸湿且质地柔软的海绵对于减少对鱼体表鳞片和黏液层的损伤至关重要。充分浸湿的海绵也有助于保持鳃部的通气。我们强烈推荐在“材料”部分下方列出的泡沫海绵。最后，一旦鱼类被麻醉，应迅速操作，以尽量缩短其处于麻醉状态的时间。

复苏： 鱼在进入温水水箱后应几乎立即从麻醉状态中恢复。如果鱼没有立即开始游动，可轻轻搅动水流使其流向鳃部，以加快复苏。如果复苏过程缓慢，则说明鱼进入麻醉状态过快，应适当调整麻醉操作步骤。复苏缓慢的可能原因在“麻醉”部分中已有讨论。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
泡沫海绵	Jaece Industries	L800-D
60 mm 培养皿
移液枪头盒盖			不要太深，例如 1.5 cm
塑料储存容器			较深，例如 7 cm
温度计
碎冰			由实验设施用水制成
温热的实验设施用水			1 升或更多
500 ml 烧杯			用于称重
NanoFil 注射器	World Precision Instruments, Inc.	NANOFIL	或 Hamilton 注射器
35 号针头	World Precision Instruments, Inc.	NF35BV-2	斜面
Silflex 管路	World Precision Instruments, Inc.	SILFLEX-2
UltraMicroPump III 和 Micro4 控制器	World Precision Instruments, Inc.	UMPS-1
脚踏开关	World Precision Instruments, Inc.	15867
解剖显微镜
塑料封口膜
纸巾
Cortland 盐溶液