用于免疫健全小鼠的浆液性卵巢癌原位模型 体内 肿瘤成像与肿瘤免疫应答的监测

摘要

为了研究 体内 肿瘤生长与肿瘤微环境，我们采用免疫功能健全动物中的同源性、原位卵巢癌小鼠模型。我们将小鼠肿瘤细胞系（MOV1）转导表达Katushka荧光蛋白（MOV1）^KAT）在此我们展示其在卵巢中的原位移植 体内 成像

摘要

背景：卵巢癌通常在晚期才被诊断，此时病死率较高，因此仍是美国女性中最致命的妇科恶性肿瘤^1,2,3。浆液性肿瘤是卵巢癌中最常见的类型^4,5，而Tg-MISIIR-TAg转基因小鼠是唯一能自发产生此类肿瘤的小鼠模型。Tg-MISIIR-TAg小鼠在苗勒管抑制物质II型受体（MISIIR）基因启动子的调控下表达SV40病毒的转化区⁶。目前已鉴定出其他一些表达SV40 TAg转基因的转基因小鼠品系，但这些小鼠不会发生卵巢肿瘤。非肿瘤倾向性小鼠的寿命与C57Bl/6小鼠典型寿命相当，且具有生育能力。这些小鼠可作为来自Tg-MISIIR-TAg-DR26小鼠分离的肿瘤细胞的同基因异体移植受体。

目标： 尽管肿瘤成像是可能的 ⁷，早期检测活体小动物体内的深部肿瘤具有挑战性。为了在免疫系统完整的动物模型中开展浆液性卵巢癌的临床前研究，我们描述了一种可用于此类卵巢癌研究的同源小鼠模型，该模型允许 体内 成像，肿瘤微环境研究及肿瘤免疫反应研究。

方法： 我们首先从一只26周龄DR26 Tg-MISIIR-TAg雌性小鼠体内分离出的自发性卵巢肿瘤中建立了一株TAg阳性小鼠癌细胞系（MOV1）。随后，我们利用编码Katushka（一种来源于海葵红色荧光蛋白的远红突变体）的TurboFP635慢病毒哺乳动物载体，对MOV1细胞进行稳定转导。 Entacmaea quadricolor 激发/发射最大值位于 588/635 nm ^8,9,10我们将MOV1进行原位移植^Kat 在卵巢中 ^11,12,13,14 非肿瘤倾向的 Tg-MISIIR-TAg 雌性小鼠。肿瘤进展通过以下方式监测 体内 通过免疫组织化学分析光学成像和肿瘤微环境。

结果： 原位移植的 MOV1^Kat 细胞发育为浆液性卵巢肿瘤。MOV1^Kat 肿瘤可通过以下方式可视化： 体内 植入后长达三周的成像（图1）显示，其内有白细胞浸润，类似于人类卵巢癌中的观察结果 ¹⁵ （图2）。

结论： 我们描述了一种适用于卵巢癌的原位模型 体内 由于Katushka在深层组织中具有高pH稳定性和光稳定性，可实现对早期肿瘤的成像。我们建议将这种新型的同源性浆液性卵巢癌模型用于 体内 肿瘤免疫反应及免疫治疗的成像研究与监测

方案

1. 细胞培养

1. 进行原位注射前，将源自DR26肿瘤的MOV1^Kat细胞在T175培养瓶中培养至90%汇合度。每例注射计划使用100万至500万个细胞，需准备1至2个T175培养瓶。
2. 注射当天，收集细胞并使用血细胞计数板测定细胞数量。
3. 确定细胞浓度后，在室温下以300 × g离心5分钟，使细胞沉淀。
4. 离心后，将细胞重悬于10微升含0.002 M EDTA的无菌PBS中，调整至每10微升含100万个细胞。

2. 术前准备

1. 手术前，用3/10 cc胰岛素注射器吸取10微升含100万MOV1-^Kat细胞的PBS EDTA溶液。
2. 将异氟烷麻醉的小鼠转移至加热垫上，并涂抹眼膏以防止眼睛脱水。随后，立即把动物头部置入与异氟烷挥发器相连的鼻罩系统，以在整个手术过程中维持麻醉状态。
3. 使用酒精棉片对注射部位消毒后，用3/10 cc胰岛素注射器皮下注射5 mg/kg的术前镇痛药酮洛芬（Ketoprofen）。
4. 使用电推剪从胸腰交界处至动物尾根部，剃除小鼠背部左侧尾侧部分的毛发。涂抹脱毛膏以彻底清除残留毛发，随后用湿纸巾擦去多余脱毛膏。
5. 毛发清除后，使用聚维碘酮-碘和酒精棉片对剃毛区域进行消毒，然后在切口周围铺置手术巾。

3. 手术

1. 手术前，将异氟烷蒸发器的浓度调节至1.5%。
2. 通过捏压足垫确认动物已完全麻醉。
3. 接着，在皮下定位脾脏。然后使用手术剪，在脾脏右上方做一长度为1-2 cm的背外侧切口。
4. 解剖后腹膜。此时可观察到围绕小鼠卵巢的脂肪垫。使用弯头镊子夹住并暴露包裹小鼠卵巢的脂肪垫。
5. 用数滴无菌PBS润湿器官。
6. 使用弯头镊子夹住、牵拉……定位……然后固定卵巢以便注射
7. 在牢固夹持卵巢的同时，向卵巢内注射10 µL MOV1^Kat 肿瘤细胞。牢固夹持可防止液体反流或泄漏。
8. 注射后立即松开镊子施加的张力。卵巢上的穿刺孔应会自行回缩并闭合。
9. 使用带针的可吸收聚乙醇酸缝线缝合后腹膜伤口。
10. 将动物从鼻罩中取出。
11. 拉伸皮肤，并用数滴组织粘合剂封闭背外侧伤口边缘。
12. 最后，经口给予动物100 µL抗生素。然后将其放回笼中并监测其恢复情况。在饮水中持续给予抗生素一周。

4. 体内 成像

1. 移植瘤注射后一周^Kat 肿瘤细胞，执行 体内 成像。首先将异氟烷麻醉的小鼠转移至成像室。
2. 将异氟烷蒸发器的浓度下调至2%。
3. 执行 体内 根据成像系统制造商的说明进行成像。在本视频中，将使用Lumina系统。
4. 要进行成像，请点击 Living Image 软件桌面图标。然后在 IVIS 采集控制面板上选择“Initialize”。仪器设置类似于相机设置。
5. 在采集控制面板上设置仪器的采集参数。对于荧光检测，勾选“荧光”选项。勾选“拍照”框，以便在每次成像时同步获取照片。
6. 接下来，将曝光时间设置为自动。在“像素合并或CCD分辨率”选项中，选择“中等”。然后在光圈值（F/stop）或孔径中，选择数值2。接着，选择535激发滤光片和DsRed发射滤光片。
7. 在视野范围内，单击“View B”以成像单只小鼠。
8. 然后，单击“acquire”以开始图像采集。
9. 图像采集完成后，使用感兴趣区域（Region of Interest，ROI）工具对信号进行测量。点击测量图标以获取信号值和面积。
10. 最后，点击“保存”以将图像保存到用户文件夹中
11. 图像采集完成后，停止异氟烷的给药，并将小鼠放回笼中。小鼠应立即苏醒。

5. 代表性结果

-使用本方案，可 体内 通过非侵入性方法可对原位卵巢癌的生长情况进行至少3周的监测。

图1. MOV1^Kat 细胞或PBS（作为阴性对照）被原位注射到非肿瘤易感小鼠的卵巢中（右侧小鼠和左侧小鼠分别进行）。 体内 2 周后进行成像。由 MOV1 产生的荧光发射^Kat 移植到卵巢中的细胞数量被测定，并与阴性对照小鼠的结果进行比较。

图 2. MOV1^Kat 卵巢肿瘤的冷冻切片使用生物素标记的抗-CD4 单克隆抗体染色，随后加入 DAB 底物（深棕色）以检测肿瘤浸润淋巴细胞（黑色箭头）。细胞经甲基绿复染以显示细胞核（蓝色）。肿瘤细胞（红色箭头）在形态上与 T 细胞不同。该切片显示放大倍数为 40 倍。

讨论

手术与原位注射

卵巢囊内原位注射需要经过训练并具备精确性。因此

1. 若手术经验不足，应先在尸体上进行练习。
2. 优先选用经产雌性小鼠（生产过一至两胎），因其卵巢随时间逐渐增大，便于注射操作，并可提高存活率，相比之下未产雌性小鼠则较难操作。
3. 由于小鼠卵巢囊膜体积较小，强烈建议使用可获得的最小规格针头。

体内成像

1. 始终使用荧光参考物，例如装有 10⁶ 至 10⁷ 个 MOV1^kat 细胞、体积为 100 μl 至 1 ml PBS 的 1.5 ml 离心管。
2. 给予动物无苜蓿饮食，以降低荧光背景。
3. 在进行 in vivo 成像前仔细剃除动物体毛，以减少背景信号。

意义

...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM-GLUTAMAX	Invitrogen	10564-011
PBS	GIBCO，Life Technologies 公司	14040
Versene	Lonza 公司	17-711E
加热垫	Deltaphase	39 DP
聚维酮垫片	Dynarex	1108
酒精棉片	费希尔科技公司	06-669-62
人工泪液软膏	Phoenix Pharmaceuticals, Inc.	17845-153
酮洛芬	Fort Dodge 动物健康公司
3cc/胰岛素注射器	BD 生物科学	309301
Polyg 聚乙醇酸缝合线/针（3/8 19mm）	Syneture	9612-31
组织粘合剂	Vetbond	3M
兽用百克素/口服混悬液	Hi-tech Pharmacal 公司	840823
IVIS-Lumina	Caliper 生命科学公司
异氟烷	Phoenix Pharmaceuticals, Inc.	J108013
合格胎牛血清	Invitrogen	10437036
青霉素/链霉素	GIBCO，Life Technologies 公司	15140
TurboFP635 哺乳动物表达载体	Evrogen	FP721
T175 培养瓶	cellstar	660-190