方法文章

用于量化细胞收缩的投诉基质的制备

DOI：

10.3791/2173

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2010年12月14日

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1Institute for Biophysical Dynamics, University of Chicago, 2Physics Department - James Franck Institute, University of Chicago, 3Interdisciplinary Scientist Training Program, University of Chicago

本文内容

摘要

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在本视频中，我们演示了用于制备适用于细胞培养的柔性、细胞外基质（ECM）包被基底的实验技术，这些基底可用于牵引力显微镜检测，并可用于观察细胞外基质刚度对细胞行为的影响。

摘要

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细胞与细胞外基质（ECM）之间黏附的调控对于细胞迁移和ECM重塑至关重要。黏着斑是将收缩性F-肌动蛋白细胞骨架与ECM偶联在一起的大分子复合物。这种连接使得细胞内机械力能够通过细胞膜传递到下方的基底。最近的研究表明，ECM的力学特性可调控黏着斑和F-肌动蛋白的形态，以及多种生理过程，包括细胞分化、分裂、增殖和迁移。因此，使用细胞培养基底已成为精确控制和调节ECM力学特性的日益普遍的方法。

为了量化贴壁细胞在黏着斑处的牵引力，需结合使用可变形基底、高分辨率成像技术和计算方法，该技术称为牵引力显微镜（TFM）。该技术依赖于测量细胞收缩所引起的基底局部形变的大小和方向。结合荧光标记蛋白的高分辨率荧光显微镜成像，可将细胞骨架的组织与重塑过程与牵引力相关联。

本文介绍了一种制备二维可变形基质的详细实验方案，旨在构建一种力学刚度明确且可调控的细胞培养基底，适用于细胞收缩力的测量。该方案包括聚丙烯酰胺水凝胶的制备、细胞外基质蛋白在凝胶表面的包被、细胞在凝胶上的接种，以及利用灌流腔室进行高分辨率共聚焦显微镜观察。此外，我们还提供了代表性数据示例，展示如何采用已报道的牵引力显微镜（TFM）技术来测定细胞力的作用位置和大小。

方案

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1. 激活盖玻片表面

  1. 盖玻片（#1.5，22×40 mm）使用先前描述的方案（Waterman-Storer, 1998）通过一系列皂液和乙醇清洗步骤进行清洁，以去除灰尘。
  2. 将盖玻片放入不锈钢支架架中，确保盖玻片之间保持间距且不相互接触。
  3. 在化学通风橱内（建议佩戴腈类手套和护目镜），将纯浓度的3-aminopropyltrimethoxysilane用异丙醇稀释至终浓度为2%（2 ml 硅烷 / 100 ml 异丙醇），注入方形玻璃皿中（约350 ml 体积）。由于该物质与塑料具有反应性，应使用玻璃巴斯德吸管将3-aminopropyltrimethoxysilane加入异丙醇中。
  4. 将步骤1.2中的盖玻片完全浸入该溶液中，在通风橱内的搅拌器上轻轻搅拌，持续10分钟。
  5. 通过将盖玻片浸入ddH2O中进行清洗（共更换4次水）。最后一次换水后静置浸泡10分钟，并持续搅拌。含氨基硅烷的溶液应作为危险废物处理。
  6. 在无尘环境中，将盖玻片置于培养箱中于温暖温度（约37°C）下干燥10分钟。
  7. 冷却至室温。
  8. 在通风橱内，将盖玻片浸入盛于玻璃方皿中的1%戊二醛ddH2O溶液中，并置于搅拌器上搅拌30分钟。
  9. 用ddH2O更换3次进行清洗，每次10分钟，并持续搅拌。戊二醛溶液应作为危险废物处理。
    10. <....

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讨论

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本文所述牵引力显微镜（TFM）实验的建立方法，结合计算追踪程序的实施（Sabass et al., 2008），可实现对细胞力的量化分析，空间分辨率达到微米级。为优化实验方案，关键在于制备纯度高、均一性好的凝胶基底，并确保细胞外基质（ECM）配体的均匀包被。以下讨论可能存在的技术难点：

凝胶表面不均匀或出现裂纹：

根据我们的经验，有几个步骤对于形成均匀良好的凝胶至关重要。如果凝胶表面出现暗色孔洞，很可能是因为玻璃载片上残留了过多的Rain-X液滴未被彻底清除，导致凝胶聚合时所面对的表面疏水性不均。此外，我们发现对于极软的凝胶（<100 Pa），由于盖玻片表面粘附的聚丙烯酰胺（PAA）凝胶溶胀受限，凝胶表面会变得高度不平整；减少这一现象的方法之一是用水替换为适当的缓冲液，从而在凝胶聚合至成像过程中维持渗透压稳定。

凝胶表面出现撕裂或裂痕可能由多种因素引起。如果在盖玻片-载玻片夹心结构拆卸前凝胶尚未完全聚合，则可能导致大面积破裂或撕裂。凝胶与载.......

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致谢

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感谢Ulrich Schwarz实验室提供了用于量化细胞牵引力的计算追踪软件（Sabass et al.，2008）。本研究得到了M.L. Gardel获得的Burroughs Wellcome职业奖和NIH主任先锋奖（DP10D00354）以及S.P. Winter获得的医学科学家国家研究服务奖（5 T32 GM07281）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3-氨基丙基三甲氧基硅烷Aldrich28, 177-8
40% 丙烯酰胺Bio-Rad161-0140
2% 双丙烯酰胺Fisher ScientificBP1404
TEMEDFisher ScientificBP 150-20
过硫酸铵Fisher ScientificBP179
40 nm 荧光微球InvitrogenF8789
磺基-SANPAHPierce, Thermo Scientific22589
共聚焦成像腔室 (RC-30)Warner Instruments64-0320
盖玻片旋转仪自制NA
紫外灯 CL1000UVP Inc.95-0228-01
不锈钢架Electron Microscopy Sciences72239-04
丙烯酰基-X, SE (6-((丙烯酰基)氨基)己酸)InvitrogenA-20770
水合肼Sigma-Aldrich225819
偏高碘酸钠Thermo Fisher Scientific, Inc.20504
异丙醇Fisher ScientificA416-4
纤连蛋白Sigma-AldrichF2006
胶原蛋白BD Biosciences354236
盖玻片 (#1.5)Corning2940‐224
戊二醛Electron Microscopy Sciences16120
Rain-XSOPUS Productswww.rainx.com
乙酸Acros Organics64-19-7

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
  2. Engler, A., Bacakova, L. N. ewman, Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. ischer

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