用于量化细胞收缩的投诉基质的制备

摘要

在本视频中，我们演示了用于制备适用于细胞培养的柔性、细胞外基质（ECM）包被基底的实验技术，这些基底可用于牵引力显微镜检测，并可用于观察细胞外基质刚度对细胞行为的影响。

摘要

细胞与细胞外基质（ECM）之间黏附的调控对于细胞迁移和ECM重塑至关重要。黏着斑是将收缩性F-肌动蛋白细胞骨架与ECM偶联在一起的大分子复合物。这种连接使得细胞内机械力能够通过细胞膜传递到下方的基底。最近的研究表明，ECM的力学特性可调控黏着斑和F-肌动蛋白的形态，以及多种生理过程，包括细胞分化、分裂、增殖和迁移。因此，使用细胞培养基底已成为精确控制和调节ECM力学特性的日益普遍的方法。

为了量化贴壁细胞在黏着斑处的牵引力，需结合使用可变形基底、高分辨率成像技术和计算方法，该技术称为牵引力显微镜（TFM）。该技术依赖于测量细胞收缩所引起的基底局部形变的大小和方向。结合荧光标记蛋白的高分辨率荧光显微镜成像，可将细胞骨架的组织与重塑过程与牵引力相关联。

本文介绍了一种制备二维可变形基质的详细实验方案，旨在构建一种力学刚度明确且可调控的细胞培养基底，适用于细胞收缩力的测量。该方案包括聚丙烯酰胺水凝胶的制备、细胞外基质蛋白在凝胶表面的包被、细胞在凝胶上的接种，以及利用灌流腔室进行高分辨率共聚焦显微镜观察。此外，我们还提供了代表性数据示例，展示如何采用已报道的牵引力显微镜（TFM）技术来测定细胞力的作用位置和大小。

方案

1. 激活盖玻片表面

1. 盖玻片（#1.5，22×40 mm）使用先前描述的方案（Waterman-Storer, 1998）通过一系列皂液和乙醇清洗步骤进行清洁，以去除灰尘。
2. 将盖玻片放入不锈钢支架架中，确保盖玻片之间保持间距且不相互接触。
3. 在化学通风橱内（建议佩戴腈类手套和护目镜），将纯浓度的3-aminopropyltrimethoxysilane用异丙醇稀释至终浓度为2%（2 ml 硅烷 / 100 ml 异丙醇），注入方形玻璃皿中（约350 ml 体积）。由于该物质与塑料具有反应性，应使用玻璃巴斯德吸管将3-aminopropyltrimethoxysilane加入异丙醇中。
4. 将步骤1.2中的盖玻片完全浸入该溶液中，在通风橱内的搅拌器上轻轻搅拌，持续10分钟。
5. 通过将盖玻片浸入ddH₂O中进行清洗（共更换4次水）。最后一次换水后静置浸泡10分钟，并持续搅拌。含氨基硅烷的溶液应作为危险废物处理。
6. 在无尘环境中，将盖玻片置于培养箱中于温暖温度（约37°C）下干燥10分钟。
7. 冷却至室温。
8. 在通风橱内，将盖玻片浸入盛于玻璃方皿中的1%戊二醛ddH₂O溶液中，并置于搅拌器上搅拌30分钟。
9. 用ddH₂O更换3次进行清洗，每次10分钟，并持续搅拌。戊二醛溶液应作为危险废物处理。
10. 在室温下干燥，并用铝箔覆盖，以防止灰尘附着在盖玻片上。
11. 储存于干燥、无尘环境中，最长可保存2个月。

2. 聚丙烯酰胺（PAA）凝胶的制备

1. 根据表1，从40%丙烯酰胺和2%双丙烯酰胺配制丙烯酰胺/双丙烯酰胺混合储备液。我们配制多种储备液，以优化不同刚度的聚丙烯酰胺（PAA）凝胶；示例见表1和表2。只要将储备液保存在避光瓶中并在4°C下储存，可保存数年。
2. 工作液中丙烯酰胺/双丙烯酰胺的最终所需浓度由储备液稀释获得。例如，我们用ddH₂O配制7.5%丙烯酰胺/0.10%双丙烯酰胺的工作液，用于制备2.8 kPa的PAA凝胶。
3. 将丙烯酰胺溶液置于真空室中脱气20分钟，以减少溶液中的氧气，防止PAA聚合受阻。
4. 配制10%过硫酸铵（APS）溶液（0.5 g/5 mL）。新鲜工作液应在3天内使用完毕。也可将储备液冷冻保存，以备后续使用。
5. 在丙烯酰胺溶液脱气的同时，用力用Rain-X擦拭布擦拭1×3英寸显微镜玻片，使玻片表面具有疏水性。为去除多余的Rain-X，再用湿润的Kimwipe纸巾擦拭玻片。将玻片盖好，放置一旁备用。
6. 将丙烯酰胺溶液从真空室中取出，加入荧光微球（体积比1%，对于表1所列工作液为5 μL）。加入0.75 μL TEMED和2.5 μL 10% APS，以启动凝胶聚合反应。用移液器吹打约5秒，充分混匀，同时尽量减少气泡产生。
7. 取10–12 μL丙烯酰胺溶液滴加至疏水性显微镜玻片（步骤2.4制备）上，然后将活化的22×40 mm盖玻片覆盖在液滴上。凝胶溶液应覆盖整个盖玻片表面。轻轻排除溶液中可能出现的气泡。室温下静置约10分钟，使凝胶完成聚合。
8. 可通过将剩余工作液倒置在微量离心管中判断聚合是否完成。此外，聚合后的凝胶可能会从盖玻片边缘收缩分离。一旦观察到宏观聚合完成，立即小心分离盖玻片与玻片。使用镊子尖端或刀片边缘，小心地将附着凝胶的盖玻片从显微镜玻片表面取下，并将凝胶浸入ddH₂O中，以保持其水合状态。

3. 将细胞外基质（ECM）蛋白偶联到PAA凝胶

可采用三种不同的方法将细胞外基质（ECM）蛋白连接到聚丙烯酰胺（PAA）凝胶的上表面（3.1 和 3.2）或将 ECM 蛋白整合到凝胶内部（3.3）。本文讨论将纤连蛋白偶联至 PAA 凝胶的方法，以获得与在 10 μg/mL 纤连蛋白溶液中孵育 1 小时后吸附在玻璃表面的蛋白量相当的表面配体密度。选择方法时的考虑因素将在讨论部分详细说明。

1. 使用 Sulfo-SANPAH 将 ECM 蛋白交联至 PAA 凝胶表面 通过双功能交联剂 Sulfo-SANPAH 将蛋白质上的反应性胺基共价连接至 PAA 凝胶表面
   1. 通过将 Sulfo-SANPAH 粉末溶解于无水二甲基亚砜（DMSO）中制备 40 μl 的工作分装液（每毫克 Sulfo-SANPAH 使用 20 μl DMSO）。在液氮中快速冷冻分装液，并于 -80°C 保存以备后续使用。
   2. 使用盖玻片旋转仪去除凝胶表面的 ddH₂O（< 2 秒）。避免使凝胶干燥。
   3. 使用前立即用 ddH₂O 稀释 Sulfo-SANPAH-DMSO 分装液（终浓度为 2 mg/ml，pH 7），并涂覆凝胶表面（约 200 μl）。注意 Sulfo-SANPAH 在水中室温下的反应半衰期较短（约 5 分钟），因此这些步骤应迅速完成。
   4. 将凝胶表面置于紫外交联仪中暴露于紫外光下（8 W，波长 254 nm，距离 2–3 英寸，照射 1.5 分钟）。Sulfo-SANPAH 的颜色将由橙色变为棕色。
   5. 将经紫外处理的盖玻片浸入盛有新鲜 ddH₂O 的烧杯中，再用盖玻片旋转仪去除凝胶表面多余水分（< 2 秒）。
   6. 在培养皿中的 Parafilm 上加入约 50 μl 冷的 1 mg/ml 纤连蛋白（FN）溶液（溶于 PBS，pH 7.4）。将盖玻片倒置覆盖在 FN 液滴上，使凝胶面接触 FN。
   7. 在室温下反应 1–2 小时，或在 4°C 下过夜反应。
   8. 在无菌条件下，将盖玻片置于含有 PBS（pH 7.4）的 6 cm 组织培养皿中，液体量需足以覆盖盖玻片，操作在组织培养超净台中进行。
   9. 在无菌条件下，用 PBS（pH 7.4）充分洗涤多次（3–5 次）。
   10. 在组织培养超净台中使用杀菌灯对盖玻片进行 30 分钟灭菌处理。
   11. 在接种细胞前，将盖玻片在细胞培养基中孵育 30–45 分钟。
2. 使用水合肼将 ECM 交联至 PAA 凝胶表面 利用水合肼将蛋白质上的糖基氧化后与凝胶偶联。
   1. 按照第 2 节所述方法制备聚丙烯酰胺凝胶。
   2. 在通风橱中，将 PAA 凝胶盖玻片放入塑料培养皿内，戴手套后向每片 PAA 凝胶表面加入约 1 ml 未稀释的水合肼，孵育至少 2 小时，但不超过 24 小时。
   3. 向培养皿中加入 ddH₂O；移除水合肼溶液，并作为危险废物妥善处理。
   4. 向培养皿中加入 5% 乙酸以浸没盖玻片。盖上皿盖，孵育 1 小时。
   5. 移除乙酸，并用 ddH₂O 洗涤。再在 ddH₂O 中孵育 1 小时。此时盖玻片已被活化，可用于交联氧化的纤连蛋白（FN）。
   6. 在避光的微量离心管中，将 10 μl 的 1 mg/ml FN 溶液加入 940 μl 的 50 mM 醋酸钠缓冲液（pH 4.5）中，终浓度为 10 μg/ml。
   7. 通过将 80 mg 偏高碘酸钠加入 1 ml 的 50 mM 醋酸钠缓冲液（pH 4.5）中，配制 20X 偏高碘酸钠储备液。
   8. 向步骤 3.2.6 配制的 FN 溶液中加入 50 μl 的 20X 偏高碘酸钠储备液，使终工作浓度为 10 μg/ml FN 和 4 μg/ml 偏高碘酸钠。在避光离心管中室温孵育 30 分钟。
   9. 使用盖玻片旋转仪去除步骤 3.2.5 制备的活化凝胶表面的多余 ddH₂O（< 2 秒）。避免使凝胶干燥。
   10. 向活化的凝胶表面加入约 500 μl FN 溶液，室温孵育 1 小时。
   11. 将盖玻片放入含有 PBS（pH 7.4）的培养皿中，液体量需足以覆盖盖玻片。
   12. 用 PBS（pH 7.4）充分洗涤多次（3–5 次）。
   13. 在组织培养超净台中使用杀菌灯对盖玻片进行 30 分钟灭菌处理。
   14. 在接种细胞前，将盖玻片在细胞培养基中孵育 30–45 分钟。
3. 通过丙烯酰基-X 琥珀酰亚胺酯在 PAA 凝胶本体中进行 ECM 蛋白的共价结合 该方案在步骤 2.5 之前进行。利用 NHS 酯化学法将蛋白质上的反应性胺基与丙烯酰胺单体偶联，随后共聚进入 PAA 凝胶本体。
   1. 根据制造商说明书将所选 ECM 蛋白与丙烯酰基-X 进行偶联。偶联后的蛋白储备液应保存于 4°C。
   2. 计算凝胶制备所需的 PAA 工作液体积（例如每张盖玻片 10 μl）。
   3. 从表 1 所列工作液配方的用水量中减去 50 μl（例如 10% 体积），然后启动聚合反应。
   4. 取出步骤 3.3.2 计算出的体积，并加入 ECM/丙烯酰基-X 溶液至总体积的 10%（例如 1 μl ECM/丙烯酰基-X 加入 9 μl PAA 溶液）。此步骤应迅速完成，因凝胶正在聚合中。
   5. 按前述方法完成步骤 2.6 和 2.7。
   6. 在无菌条件下，用 PBS（pH 7.4）充分洗涤多次（3–5 次）。
   7. 在组织培养超净台中使用杀菌灯对盖玻片进行 30 分钟灭菌处理。
   8. 在接种细胞前，将盖玻片在细胞培养基中孵育 30–45 分钟。

4. 将盖玻片装入共聚焦成像腔室

在细胞于ECM包被的凝胶基质上铺展后（约6-12小时），进行以下步骤。组装共聚焦成像室（RC-30WA）时，建议参考Warner Instruments公司的官方网站以获取操作指导。

1. 将细胞培养基和0.5%或0.25%胰蛋白酶预热，并吸入5ml或10ml注射器中。
2. 使用真空脂将22×30 mm盖玻片固定在Warner Instruments共聚焦成像室（RC-30WA）的上盖玻片支架上，以确保盖玻片位置稳定。
3. 将用于形成腔室的橡胶垫圈置于盖玻片上方，确保聚乙烯进样和出样管均可接入。根据所用垫圈的尺寸，可在上盖玻片与涂有凝胶的22×40 mm盖玻片之间形成150–1000 μm的间距。
4. 通过连接套件将注射器连接至进样管，检查培养基是否顺利流经管道并到达上盖玻片表面，且流路中无气泡产生。
5. 在腔室底部涂抹真空脂，将涂有凝胶的22×40 mm盖玻片（细胞面朝上）安装到位，并向细胞中加入预热的培养基。
6. 将上盖玻片支架放置在腔室底座上，中间由腔室垫圈隔开，确保腔室底座内的定位销插入上盖玻片的定位孔中。
7. 将压力板安装至腔室底座，并使用压力板扳手旋紧并固定压力板。
8. 检查培养基在管道和腔室中的流动情况，以监测腔室是否存在泄漏，并消除细胞表面的无培养基区域。注意：在灌注培养基的同时，使用细径针头施加轻微负压，有助于消除无培养基区域。
9. 将共聚焦成像室安装至显微镜支架中的载物台适配器上，进行成像。
10. 在共聚焦荧光显微镜下对凝胶基质中嵌入的荧光标记蛋白和荧光微球进行成像。
11. 为了获得凝胶内未受应力作用的微球位置图像，灌注胰蛋白酶以解离细胞与凝胶之间的黏附连接，并在同一成像视野中采集细胞脱离后荧光微球的图像。通过比较受力与未受力状态下微球的位置，可量化细胞收缩过程中凝胶基质的位移。

代表性结果：

上述方案描述了制备用于研究细胞收缩力的可变形PAA凝胶的实验步骤，如图1所示。采用本方案获得的凝胶表面相对平坦且光滑，荧光微球在整个凝胶中均匀分布（图2A）。

若需在黏着斑位置测量凝胶收缩，则应在黏着斑的共聚焦光学平面上对细胞（图3A）和凝胶表面（图3B）进行成像。当细胞附着（受力）与脱离（无应力）时，可通过观察凝胶表面嵌入的荧光微球的位移来可视化凝胶的收缩（图3B）。利用计算算法可获得与微球位移相关的牵引应力以及凝胶相应的弹性模量（图3C和3D）（Sabass et al., 2008）。如果成像位置位于凝胶更深层，则微球位移将更小，无法准确反映黏着斑处施加的牵引力。

图1. 实验装置示意图。本实验的总体目标是制备可变形基质，用于研究细胞收缩。实验的第一步是通过氨基硅烷/戊二醛处理活化盖玻片，以便锚定聚合后的凝胶。第二步是在活化的盖玻片上聚合含有荧光微球的聚丙烯酰胺凝胶。第三步是采用步骤3中列出的三种偶联技术之一，将细胞外配体化学交联至聚丙烯酰胺凝胶表面。随后将细胞接种到凝胶上，使其黏附并铺展。在细胞主动收缩作用下，嵌入凝胶中的微球发生位移。

图2. 通过（A）嵌入凝胶中的荧光40 nm微球和（B）纤连蛋白免疫荧光所观察到的PAA凝胶顶面的光学共聚焦切片图像。

图3. 牵引力实验的代表性结果。(A.) 人骨肉瘤U2OS细胞中的黏着斑由GFP-paxillin标记；(B.) 黏着斑下方聚丙烯酰胺（PAA）凝胶中嵌入的荧光微球在受拉伸（绿色）和未受拉伸（红色）状态下的位置。箭头表示微球位移的示例。(C.) 牵张应力矢量图，以及(D.) 通过计算算法（Sabass et al., 2008）从凝胶收缩中推导出的相应牵引应力热图。比例尺 = 5 μm。

表1：

示例储备液和工作用PAA溶液（表1中的数据最初来自Yeung et. al.，并在我们的实验室中独立验证）。

聚丙烯酰胺储备溶液
聚丙烯酰胺凝胶的剪切模量 (Pa)	230	2833	8640	16344
40% 丙烯酰胺 (mL)	1.25	3.12	2.34	2.50
2% 双丙烯酰胺 (mL)	0.50	0.83	1.88	0.60
水 (mL)	3.25	1.04	0.78	1.90
总体积 (mL)：	5	5	5	5

工作用PAA溶液
使用的储存液 (Pa)	230	2833	8640	16344
储存液体积 (μL)	150	150	200	300
水 (μL)	341.75	341.75	291.75	191.75
微珠 (μL)	5	5	5	5
TEMED (μL)	0.75	0.75	0.75	0.75
10% APS (μL)	2.5	2.5	2.5	2.5
总体积 (μL):	500	500	500	500
最终丙烯酰胺%	3	7.5	7.5	12
最终双丙烯酰胺%	0.06	0.1	0.3	0.15

表2：

不同终浓度丙烯酰胺和双丙烯酰胺百分比的PAA基底的剪切模量

12% 丙烯酰胺			7.5% 丙烯酰胺
% 双丙烯酰胺	剪切模量 (Pa)		% 双丙烯酰胺	剪切模量 (Pa)
0.145	16344		0.01	689
0.28	30067		0.03	1535
0.45	34263		0.05	2286
0.55	42375		0.075	2833
0.575	50873		0.1	4069
0.6	55293		0.2	5356
			0.3	8640
5% 丙烯酰胺			3% 丙烯酰胺
% 双丙烯酰胺	剪切模量 (Pa)		% 双丙烯酰胺	剪切模量 (Pa)
0.05	430		0.02	1.3
0.075	600		0.04	54
0.1	1431

讨论

本文所述牵引力显微镜（TFM）实验的建立方法，结合计算追踪程序的实施（Sabass et al., 2008），可实现对细胞力的量化分析，空间分辨率达到微米级。为优化实验方案，关键在于制备纯度高、均一性好的凝胶基底，并确保细胞外基质（ECM）配体的均匀包被。以下讨论可能存在的技术难点：

凝胶表面不均匀或出现裂纹：

根据我们的经验，有几个步骤对于形成均匀良好的凝胶至关重要。如果凝胶表面出现暗色孔洞，很可能是因为玻璃载片上残留了过多的Rain-X液滴未被彻底清除，导致凝胶聚合时所面对的表面疏水性不均。此外，我们发现对于极软的凝胶（<100 Pa），由于盖玻片表面粘附的聚丙烯酰胺（PAA）凝胶溶胀受限，凝胶表面会变得高度不平整；减少这一现象的方法之一是用水替换为适当的缓冲液，从而在凝胶聚合至成像过程中维持渗透压稳定。

凝胶表面出现撕裂或裂痕可能由多种因素引起。如果在盖玻片-载玻片夹心结构拆卸前凝胶尚未完全聚合，则可能导致大面积破裂或撕裂。凝胶与载...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-氨基丙基三甲氧基硅烷	Aldrich	28, 177-8
40% 丙烯酰胺	Bio-Rad	161-0140
2% 双丙烯酰胺	Fisher Scientific	BP1404
TEMED	Fisher Scientific	BP 150-20
过硫酸铵	Fisher Scientific	BP179
40 nm 荧光微球	Invitrogen	F8789
磺基-SANPAH	Pierce, Thermo Scientific	22589
共聚焦成像腔室 (RC-30)	Warner Instruments	64-0320
盖玻片旋转仪	自制	NA
紫外灯 CL1000	UVP Inc.	95-0228-01
不锈钢架	Electron Microscopy Sciences	72239-04
丙烯酰基-X, SE (6-((丙烯酰基)氨基)己酸)	Invitrogen	A-20770
水合肼	Sigma-Aldrich	225819
偏高碘酸钠	Thermo Fisher Scientific, Inc.	20504
异丙醇	Fisher Scientific	A416-4
纤连蛋白	Sigma-Aldrich	F2006
胶原蛋白	BD Biosciences	354236
盖玻片 (#1.5)	Corning	2940‐224
戊二醛	Electron Microscopy Sciences	16120
Rain-X	SOPUS Products	www.rainx.com
乙酸	Acros Organics	64-19-7