体外培养神经嵴干细胞(NCSC)需要使用特殊的培养基(NCSCM)。NCSCM的关键成分是鸡胚提取物(CEE)。本文详细描述了制备最大产量的高纯度、高质量CEE的准确技术,包括分离、匀浆、离心和过滤等步骤的具体操作细节。
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体外培养神经嵴干细胞(NCSC)需要使用特殊的培养基(NCSCM)。NCSCM的关键成分是鸡胚提取物(CEE)。本文详细描述了制备最大产量的高纯度、高质量CEE的准确技术,包括分离、匀浆、离心和过滤等步骤的具体操作细节。
神经嵴在胚胎发生过程中起源于神经外胚层,且仅暂时存在。早期实验已证实,多能前体细胞是神经嵴的重要组成部分。1表型上,神经嵴干细胞(NCSC)在其从神经嵴迁移过程中,通过同时表达 p75(低亲和力神经生长因子受体,LNGFR)和 SOX10 进行定义。2,3,4,5这些前体细胞可分化为平滑肌细胞、嗜铬细胞、神经元和胶质细胞,以及黑色素细胞、软骨和骨6,7,8,9. 培养NCSC 体外需要一种特殊的神经嵴干细胞培养基(NCSCM)10NCSCM 中最复杂的部分是鸡胚提取物(CEE)的制备,CEE 是神经嵴干细胞(NCSC)以及其他类型神经外植体所需生长因子的重要来源。除 CEE 外,NCSCM 的其他成分均可从商业途径获得。使用实验室常规设备制备 CEE 时,了解分离、研磨、离心和过滤等关键步骤中的技术难点至关重要。本方案中,我们详细描述了获得最大产量且高纯度、高质量 CEE 的精确技术。
作者声明,动物实验严格遵循欧洲共同体理事会指令(86/609/EEC),并依照美国国立卫生研究院(NIH)关于实验操作中动物护理与使用的指南,以及德国杜伊斯堡-埃森大学机构动物护理与使用委员会(IACUC)所制定的规定进行。
第1部分:准备工作(视频中未展示)
准备材料与溶液(在将卵从培养箱中取出之前)
第2部分:鸡胚胎的解剖(视频演示)
第3部分:鸡胚胎的解离
第4部分:鸡胚-DMEM悬浮液的离心
第5部分:鸡胚提取物的过滤
离心后可见三个相:上层为含有脂肪碎片的浑浊液体,中间为澄清的液体相,底部为离心管中的沉淀。注意:必须严格避免摇动或剧烈移动离心后的混合物,否则会导致中间澄清液体相丢失,从而破坏离心步骤的结果。
注意:以下所有步骤均须在层流空气净化台内无菌条件下进行:
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本方案基于以往报道过的实验方法的改进10,11。与先前发表的文献相比,本文更详细地展示了该流程的各个独立步骤,有助于实验人员掌握关键细节,确保操作正确并获得可靠的结果。此外,由于解剖过程是鸡胚提取(CEE)的关键环节,本文对从卵黄囊中取出胚胎的操作进行了详尽描述。以下将讨论若干需要注意的重要事项。
孵化结束后应尽快开始鸡胚的解剖。解剖前已死亡的胚胎不得用于本方案的任何步骤,因为酶的激活和蛋白质降解可能对结果产生不利影响。
在开始之前,应进行一些动手训练,因为解剖过程的每一步都必须快速且准确地完成。为确保整个操作的成功,必须避免卵黄污染,因为卵黄含有大量具有显著负干扰作用的蛋白质。胚胎从卵黄囊中取出后,应迅速进行去头处理(视频中未展示)。
离心机的温度以及转子的转速也非常重要。为避免酶被激活以及NCSCM所需因子在质和量上的减少,应将离心机和转子的温度降至4°C。离心步骤完成后,上清液中央透明的液体层即为关键的预提取物,其中含有NCSCM所需的关...
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Markus Pajtler 和 Robert Bohrer 在本实验方案的可视化方面提供的支持与建议极为宝贵。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 孵化11天的鸡胚 | Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH | ||
| 酒精消毒喷雾 | Schülke Mayr GmbH | ||
| DMEMGlutamax | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 无菌注射器(60 ml) | BD Biosciences | ||
| 无菌离心管(50 ml;15 ml) | Greiner Bio-One | ||
| 无菌移液器吸头 | Starlab GmbH | ||
| 透明质酸酶 IV-S 型 | Sigma-Aldrich | ||
| Millipore 无菌滤器(0.45;0.22 μl) | Fisher Scientific | ||
| 无菌移液管(25 ml;10 ml;5 ml) | Greiner Bio-One | ||
| 离心机 L5-50 | 转子型号 Ti-45 |
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