制备鸡胚提取物以培养小鼠神经嵴干细胞

摘要

体外培养神经嵴干细胞（NCSC）需要使用特殊的培养基（NCSCM）。NCSCM的关键成分是鸡胚提取物（CEE）。本文详细描述了制备最大产量的高纯度、高质量CEE的准确技术，包括分离、匀浆、离心和过滤等步骤的具体操作细节。

摘要

神经嵴在胚胎发生过程中起源于神经外胚层，且仅暂时存在。早期实验已证实，多能前体细胞是神经嵴的重要组成部分。¹表型上，神经嵴干细胞（NCSC）在其从神经嵴迁移过程中，通过同时表达 p75（低亲和力神经生长因子受体，LNGFR）和 SOX10 进行定义。^2,3,4,5这些前体细胞可分化为平滑肌细胞、嗜铬细胞、神经元和胶质细胞，以及黑色素细胞、软骨和骨^6,7,8,9. 培养NCSC 体外需要一种特殊的神经嵴干细胞培养基（NCSCM）¹⁰NCSCM 中最复杂的部分是鸡胚提取物（CEE）的制备，CEE 是神经嵴干细胞（NCSC）以及其他类型神经外植体所需生长因子的重要来源。除 CEE 外，NCSCM 的其他成分均可从商业途径获得。使用实验室常规设备制备 CEE 时，了解分离、研磨、离心和过滤等关键步骤中的技术难点至关重要。本方案中，我们详细描述了获得最大产量且高纯度、高质量 CEE 的精确技术。

方案

作者声明，动物实验严格遵循欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC），并依照美国国立卫生研究院（NIH）关于实验操作中动物护理与使用的指南，以及德国杜伊斯堡-埃森大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）所制定的规定进行。

第1部分：准备工作（视频中未展示）

准备材料与溶液（在将卵从培养箱中取出之前）

• 鸡蛋需在37°C（100°F）的加湿培养箱中孵育11天。
• 70%乙醇喷雾、洁净培养皿、精密洁净镊子、置于冰上的4°C（40°F）无菌DMEM培养基，以及60 mL无菌注射器
• 需将50 mL无菌Corning离心管装入一半体积的4°C冷DMEM培养基，用于以1:1的比例（匀浆组织:DMEM）混合匀浆后的胚胎。一旦将鸡蛋从培养箱中取出，应立即开始鸡胚解剖。
• 解剖工具须通过高压灭菌器灭菌，或在解剖当天将工具浸入70%乙醇中20分钟。

第2部分：鸡胚胎的解剖（视频演示）

1. 用70%乙醇喷雾湿润已孵育的鸡蛋，至少持续30秒，并用洁净的软纸巾小心擦干，注意不要过度摇晃鸡蛋。
   注意：建议同时解剖的鸡胚不超过60个。
2. 通过将蛋壳轻击锋利边缘小心打开，谨慎取出胚胎，避免破坏卵黄囊或鸡胚本身。
3. 迅速找到脐带起始位置，小心撕开透明包裹膜，避免损伤卵黄囊或细小血管，然后使用精确洁净的镊子解剖脐带。
4. 将胚胎从卵黄囊中取出。
   注意：应迅速将胚胎断头处理（视频中未展示）。
5. 将胚胎收集至4°C的最低必需培养基中。

第3部分：鸡胚胎的解离

1. 从一个 60 mL 无菌注射器中取出活塞。
2. 将约 10 个胚胎转移至一个 60 mL 注射器中。
3. 小心地将活塞重新插入注射器，以免损失匀浆材料。
4. 通过下压活塞进行匀浆处理。
5. 将匀浆后的组织收集到预先准备好的 Corning 管中，管内已加入半满的 DMEM，匀浆物与 DMEM 的体积比为 1:1。使用 10 个胚胎时，可获得约 25 mL 的混合液。
6. 将混合液置于摇床中，在 4°C 下振荡 45 分钟。

第4部分：鸡胚-DMEM悬浮液的离心

1. 将鸡胚-DMEM悬浮液转移至离心管中。
2. 加入无菌透明质酸酶，浓度为每25 mg胚胎加入1 mg。
3. 精确去皮重离心管。
   注意：此步骤需谨慎操作，因离心过程使用极高的离心力，若使用不平衡的离心管，可能导致材料或离心机损坏。应使用高精度天平，通过向DMEM中添加缺失的量，使所有离心管在小数点后三位数值上保持一致。
4. 将离心机温度降至4°C。
   注意：离心转子也应于前一晚存放于冷藏室或冰箱中。
5. 至少离心6小时，离心力为180,000 × g × h。注意：为获得更优的各相分离效果，建议使用266,000 × g × h。如条件允许，使用真空调节功能。

第5部分：鸡胚提取物的过滤

离心后可见三个相：上层为含有脂肪碎片的浑浊液体，中间为澄清的液体相，底部为离心管中的沉淀。注意：必须严格避免摇动或剧烈移动离心后的混合物，否则会导致中间澄清液体相丢失，从而破坏离心步骤的结果。

注意：以下所有步骤均须在层流空气净化台内无菌条件下进行：

1. 用移液器将澄清的液体相转移至孔径为 0.45 μm 的滤器系统中，然后开启连接的真空泵。
   注意：切勿触碰底部的沉淀物，否则会导致提取物污染以及滤器系统堵塞。
2. 将预提取液转移至孔径为 0.22 μm 的滤器系统中，并再次开启连接的真空泵。
3. 将获得的鸡胚提取液分装至无菌的 15 mL Corning 管中。
4. 迅速将分装样品储存于 -80°C (-62°F)。注意：若保存在 -80°C，CEE 可稳定保存长达两年。

讨论

本方案基于以往报道过的实验方法的改进^10,11。与先前发表的文献相比，本文更详细地展示了该流程的各个独立步骤，有助于实验人员掌握关键细节，确保操作正确并获得可靠的结果。此外，由于解剖过程是鸡胚提取（CEE）的关键环节，本文对从卵黄囊中取出胚胎的操作进行了详尽描述。以下将讨论若干需要注意的重要事项。

孵化结束后应尽快开始鸡胚的解剖。解剖前已死亡的胚胎不得用于本方案的任何步骤，因为酶的激活和蛋白质降解可能对结果产生不利影响。

在开始之前，应进行一些动手训练，因为解剖过程的每一步都必须快速且准确地完成。为确保整个操作的成功，必须避免卵黄污染，因为卵黄含有大量具有显著负干扰作用的蛋白质。胚胎从卵黄囊中取出后，应迅速进行去头处理（视频中未展示）。

离心机的温度以及转子的转速也非常重要。为避免酶被激活以及NCSCM所需因子在质和量上的减少，应将离心机和转子的温度降至4°C。离心步骤完成后，上清液中央透明的液体层即为关键的预提取物，其中含有NCSCM所需的关...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
孵化11天的鸡胚	Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH
酒精消毒喷雾	Schülke Mayr GmbH
DMEMGlutamax	GIBCO, by Life Technologies
无菌注射器（60 ml）	BD Biosciences
无菌离心管（50 ml；15 ml）	Greiner Bio-One
无菌移液器吸头	Starlab GmbH
透明质酸酶 IV-S 型	Sigma-Aldrich
Millipore 无菌滤器（0.45；0.22 μl）	Fisher Scientific
无菌移液管（25 ml；10 ml；5 ml）	Greiner Bio-One
离心机 L5-50	转子型号 Ti-45