Summary
Nous avons développé un modèle de patte postérieure alternant le déchargement chez la souris. Le principal avantage de notre membre postérieur déchargement queue anneau de méthode au cours de la traditionnelle Morey-Holton queue de traction technique est une procédure simple et directe qui minimise le stress sur l'animal.
Abstract
Le Morey-Holton hindlimb déchargement (HU) est une méthode largement acceptée National Aeronautics and Space Administration (NASA) basé au sol modèle pour étudier désuétude-atrophie chez les rongeurs 4-6. Notre étude a évalué une méthode alternant à l'étalon-or de Morey-Holton HU queue de traction technique chez la souris. Cinquante-quatre souris femelles (4-8 mo.) Ont été HU pendant 14 jours (n = 34) ou 28 jours (n = 20). Récupération de Hu a été évaluée après 3 jours de marche en cage normal après HU (n = 22). Âgés de souris apparié (n = 76) a servi de port de poids contrôles.
Avant HU un anneau de queue a été formée avec un fil d'acier 2-0 chirurgical stérile qui a été adoptée par la 5 ème, 6 ème, 7 ème ou de l'espace disque intervertébral et façonné dans un anneau à partir de laquelle les souris ont été suspendues. Lieu vertébrale pour la queue-anneau a été sélectionné pour un juste équilibre entre le poids corporel des animaux, sans interférer avec la défécation.
Nous avons déterminé le succès de cette nouvelle technique HU en évaluant le poids corporel avant et après HU, degré d'atrophie du soléaire, et HU masse surrénalienne suivantes. Le poids corporel des souris avant HU (24,3 ± 2,9 g) n'a pas significativement baisser immédiatement après 14j de HU (22,7 ± 1,9 g), 28d de HU (21,3 + 2,1 g), ou après trois jours de récupération (24,0 ± 1,8 g) . La masse du muscle soléaire significativement diminué (-39,1%, -46,6% et) après HU pendant 14 jours et 28 jours respectivement (p <0,001). Après trois jours de la reprise de masse soléaire significativement augmenté à 74% des valeurs de contrôle. Poids des glandes surrénales de souris HU ne sont pas différents par rapport aux souris témoins.
Le succès de notre méthode HU roman est attestée par le maintien du poids corporel des animaux, comparables poids des glandes surrénales, et l'atrophie soléaire suivantes HU, correspondant aux valeurs littérature attendus 2, 7, 8. Les principaux avantages de cette méthode HU comprennent: 1) la facilité d'un examen lors de la queue de suspension; 2) une probabilité moindre de queue cyanosée, enflammée, et / ou nécrotiques fréquemment observés avec la queue de la copie privée et HU; 3) pas de possibilité de mâcher des souris de la traction bande et sortir de l'appareil de suspension et 4) une récupération rapide et de l'activité normale en cage immédiatement après HU.
Protocol
Pré-Chirurgie Instruments / Matériaux
- Pince coupante / pince
- Gauze 2 x 2 "tapis
- Coussin chauffant
- Bâtons de nitrate d'argent
- Gants chirurgicaux stériles
- L'inhalation isoflurane anesthésie
- Gluconate de chlorhexidine à 4% (antiseptique lavage chirurgical)
- Stérile en acier chirurgical de suture 2-0
- 25 X 5 / 8 Une aiguille de la jauge (autoclave)
- Hémostatique (autoclave)
- Sutures en acier chirurgical
Procédure de chirurgie
- Créer un champ stérile. Suivez la procédure stérile.
- Anesthetize souris avec 2 - 3% d'isoflurane.
- Placez la souris sur le coussin chauffant.
- Frotter la queue avec une solution de chlorhexidine.
- Localisez l'espace e 5, 6, ou 7 intervertébral (entre deux bosses osseuses sur la queue, commencez à compter de la fin des poils du corps, à la base de la queue).
- Utilisez hémostatique et d'une aiguille 25G de faire un trou entre deux vertèbres, dans l'espace intervertébral.
- Utilisez la pince coupante pour couper le fil de suture en acier de 10 cm de long.
- Retirer l'aiguille et insérez de suture en acier à travers le trou de 5 cm de suture à chaque extrémité de la queue.
- Chaque côté de la queue doit avoir + 5 cm de suture.
- Placez le pouce sur la pointe de la queue.
- Utilisez votre main libre et le vent de la suture en acier sur le bout de votre pouce et tordre les extrémités pour former une grande boucle. La partie la plaie ou circulaire devrait être + 3 mm de long.
- Enlevez votre pouce.
- Pince un brin de suture avec la pince hémostatique et le plier en une petite boucle, la fin de laquelle est attaché aussi près que possible de la torsion sur la boucle d'origine grands.
- Coupez l'excédent de câble, et plier le fil torsadé en arrière.
- S'il ya un saignement excessif, vous pouvez l'arrêter avec les bâtons de nitrate d'argent.
- Éteignez la souris isoflurane et le placer dans une cage seule maison pour récupérer pendant 5-7 jours avant le déchargement des membres postérieurs. Les anneaux de la queue s'emmêler si plus d'une souris est logés ensemble.
1. Déchargement des membres postérieurs
Matériaux
- Taille 10-24 X 4 vis, un par animal.
- Nylon Taille écrou de 10 à 24, un par animal.
- Aile de noix de taille 10 x 24, deux par animal.
- Rondelle de taille ¼ X 1, deux par animal.
- Pêche pivotant avec la taille de mousqueton # 6, 1-11/16 ", et un animal par.
- Machine à coudre en métal canette. Un animal par.
- Petit trombone en forme de S pour le crochet, un par animal
- Pince.
- 2 x 2 "gaze.
- 2 "noir pinces liant papier.
- Duct Tape / lab bande.
- 1-3/8 "barre en acier plaqué fente qui s'étend légèrement au-delà sur toute la longueur de la cage
- 50cm x 40cm x 20cm en cage (cage rat).
- Bouteille d'eau avec un tube coudé.
- Fil d'acier inoxydable, en forme de U pour soutenir une bouteille d'eau.
Configuration Cage
- Poser les 1-38 "barre en acier plaqué fente sur le dessus de la cage, et scotchez-temporellement vers le bas avec du ruban adhésif.
- Vis 1 écrou à la vis de la machine, insérer une rondelle, et insérez le creux Vis machine à la plaque d'acier fendue ± 15 cm du bord de la cage.
- Ajouter une autre rondelle et l'écrou papillon. Serrer les écrous à oreilles à la fois, mais ne serrez pas complètement, comme il sera nécessaire de faire des ajustements ultérieurs.
- Insérez la vis machine à travers le trou central de la canette.
- Pour empêcher la bobine de tomber, vis-écrou en nylon à l'extrémité de la vis de la machine. La canette doit pivoter librement.
- Insérez le mousqueton de l'émerillon de pêche à travers la partie inférieure de la canette.
- Utilisez des pinces pour former un crochet en forme de S à partir du trombone. (Coupe 2cm du trombone pour former un crochet).
- Insérez une extrémité de l'hameçon en forme de S à travers le trou de l'émerillon de pêche et une pincée le fermer avec les pinces.
- Placez le fil en forme de U, parallèlement à la vis de la machine, à l'intérieur de la partie cage, et plier les extrémités de retour pour soutenir une pleine bouteille d'eau.
- Insérer la bouteille d'eau dans le fil en forme de U, avec la spicket vers le bas, mais pas toucher le fond.
- Pliez les deux «liant pince ouverte, de sorte qu'ils ne peuvent pas arrêter à proximité. Juste assez de tension pour tenir 3 ou 4 morceaux de nourriture en elle sans qu'elle tomber. Ceci est la prévention de la force de la pince de la trituration des aliments, ou à réprimer le le nez de la souris.
- Placer 3 ou 4 morceaux de rongeur chow dans la pince de liant.
Déchargement du membre postérieur de la souris
- Insérez l'extrémité ouverte du crochet en forme de S à travers le petit anneau de l'anneau de la queue.
- Ajustez la hauteur de la souris en serrant ou desserrant l'écrou de l'aile inférieure de la vis de la machine. Les extrémités inférieures ne doit pas être mise en charge. Une fois la hauteur optimale est obtenue serrer l'écrou supérieur.
- Repositionner la bouteille d'eau, et de fil en forme de U de sorte que la souris ne peut pas monter sur le spicket avec ses membres postérieurs. Fixez la bouteille d'eau avec du ruban adhésif sur le côté de la cage.
- Position de la pince liant avec de la nourriture sur le fond de la cage de sorte que la souris ne peut pas monter sur elle, elle ruban adhésif avec du ruban adhésif.
- Répétez la même procédure si plus d'un animal est déchargé des membres postérieurs de l'autre côté de la cage. Chambre deux animaux par cage; l'espace des animaux afin qu'ils puissent se touchent presque.
- Utilisez le 2 X 2 gaze pour enrouler la queue de la souris sur l'émerillon de poisson. Utiliser un petit morceau de ruban à enrouler autour de la gaze, la sécurisation de la gaze à la queue. Cette étape est importante pour éviter la queue de la baisse tombantes, conduisant à l'accumulation de sang dans l'extrémité de la queue et que la queue se nécroser.
- Ajouter une petite quantité de la literie en torchis à la cage. Ne pas ajouter de la litière trop sinon la souris à partir d'un monticule de literie et de tentative de chargement postérieurs sur la literie.
2. Les résultats représentatifs:
Pour établir le succès de la technique de la queue-anneau HU, nous avons mesuré le poids corporel des animaux avant la chirurgie anneau de la queue, et avant et après HU et la récupération, la masse du muscle soléaire, et la masse des surrénales dans tous les groupes.
Le poids corporel des souris à travers l'expérience sont présentés dans la figure 1. Le poids corporel des souris avant la chirurgie anneau de la queue (24,7 ± 3,5 g) n'étaient pas significativement différents après 5 jours de la reprise de la chirurgie anneau de la queue (24,3 ± 2,9 g) avant de HU. N'a pas non plus le poids corporel diminue considérablement immédiatement après 14 jours de HU (22,7 ± 1,9 g), 28 jours d'HU (21,3 + 2,1 g) ou de récupération après 3 jours à partir de HU (24,0 ± 1,8 g). Bien HU pour les 14 et 28 jours a entraîné une légère perte (-6,8% et 12%) mais non significative de la masse corporelle, les souris complètement récupéré de leur pré-HU poids après 3 jours de récupération. La consommation alimentaire des souris contrôles ambulatoires et les souris HU est montré dans la figure 3. La ration alimentaire moyenne n'était pas différente chez les souris HU plus de 28 jours par rapport aux contrôles.
Nous avons observé une atrophie du muscle soléaire significatifs suivants HU pour les 14 et 28 jours (-39,1%, -46,6% et) indiquant une procédure efficace HU (figure 2). En outre, ce degré d'atrophie est compatible avec les valeurs de la littérature prévu pour 2-4 semaines de HU 2, 7, 8. Après trois jours de la reprise du HU soléaire de masse significativement augmenté à 74% des valeurs de contrôle. Soleus masse dans le groupe de reprise a été significativement plus importante que les groupes HU fois, mais toujours beaucoup moins que les animaux témoins ambulatoires.
Poids des surrénales a été mesurée comme un indicateur du stress des animaux; les glandes surrénales gauche et droite ont été excisés et pesés. Les poids moyens étaient comparables pour le contrôle et la souris HU souris dans tous les groupes (figure 4).
Auparavant chez les rats nous avons montré que le taux de réussite pour le nombre d'animaux au début de HU par rapport au nombre d'animaux qui ont rempli HU sans sortir de l'appareil de suspension (en raison de mâcher des animaux à travers le ruban queue de traction) était de 10 à de 12 en utilisant la technique de Morey-Holton 1. Aucune des souris (n = 54) dans cette étude jamais descendu de cette suspension avant la fin de la période de HU. Nous n'avons cependant, ont une souris qui qui a développé une queue d'une inflammation sévère. Lorsque l'inflammation est devenu évident, nous avons retiré l'anneau de queue pour permettre à la zone enflammée à guérir, et ensuite placé un autre anneau de la queue-de compléter la durée de la HU.
Dans le passé, lorsque nous avons utilisé la méthode de Morey-Holton de HU, nous éliminent généralement 1-2 souris / groupe parce qu'ils sortent de l'appareil de suspension. Avec la méthode des sentiers torique n'y avait pas d'épisodes de souris par inadvertance sortant de l'appareil HU pendant la période de HU pour 14 ou 28 jours (n = 54 souris).
Figure 1. Changements de poids corporel (moyenne ± écart type). Abréviations: CON: les souris de contrôle de poids-roulement (n = 76); pré-HU: toutes les souris avant de HU (n = 54); HU14: hindlimb souris déchargée pendant 14 jours (n = 34); HU28: hindlimb souris déchargés 28 jours (n = 20); REC: souris hindlimb déchargé autorisé à récupérer la cage pour 3 jours (n = 22). Aucune différence significative du poids corporel ont été observées entre les groupes.
Figure 2. Atrophie du muscle soléaire (moyenne ± écart type). Abréviations: CON: les souris de contrôle de poids-roulement (n = 76); HU14: hindlimb souris déchargée pendant 14 jours (n = 34); HU28: hindlimb souris déchargée pendant 28 jours (n = 20) et REC: souris hindlimb déchargé autorisé à la cage de récupérer pendant 3 jours (n = 22). * Significativement différent (p <0,001) que de poids-roulement de contrôle (CON). δSignificantly différentes (p <0,01) que les groupes HU deux.
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Consommation alimentaire Figure 3. (Moyenne ± écart type). La ration alimentaire moyenne (g / jour) pendant poids du corps et des membres postérieurs déchargement. Abréviations: les souris de contrôle de poids-roulement (n = 76); HU: souris hindlimb unloaded14 - 28 jours. Aucune différence significative entre les groupes CON et HU ont été observés.
Figure 4. Masse surrénalienne (moyenne ± écart type). Abréviations: CON: les souris de contrôle de poids-roulement (n = 76); HU14: hindlimb souris déchargée pendant 14 jours (n = 34); HU28: hindlimb souris déchargée pendant 28 jours (n = 20) et REC: souris hindlimb déchargé autorisé à la cage de récupérer pendant 3 jours (n = 22). Aucune différence significative n'a été observée entre les groupes.
Discussion
Nous avons évalué une méthode alternative de souris hindlimb déchargement, dont nous avons déterminé à être un grand succès. La méthode la queue-anneau tel que décrit ici a été utilisé pour la suspension des membres postérieurs à long terme, et d'étudier HU récupération après. Sous chacune de ces conditions, il n'y avait aucune preuve d'incapacité à s'adapter comme en témoigne la prise alimentaire stable, le poids corporel et du poids des surrénales de la souris. Cette technique queue anneau HU est facile à réaliser et peut être facilement intégrée à la pratique chirurgicale très peu.
Il ya plusieurs avantages de la queue-anneau méthode par rapport à la traditionnelle Morey-Holton 5, 6 méthode. Tout d'abord, la peau et du site d'implantation anneau sur la queue qui sont toujours visibles, donc si des problèmes surviennent, il est évident immédiatement, non pas seulement à la fin de la période de suspension. Deuxièmement, les animaux ne sont pas en mesure de sortir de l'appareil de suspension à tout moment pendant HU, évitant la nécessité de rendre une décision de savoir s'il faut garder une souris ou pas dans l'ensemble des données. Par ailleurs, les souris ne se soucient pas de l'appareil ring et quand ils sont libérés de HU pour la reprise, ils n'ont pas altérer leur queue, permettant une phase de reprise transparente après HU. Enfin, des membres postérieurs des souris déchargé avec la méthode tail-anneau de maintenir leur poids corporel supérieure des membres postérieurs des souris déchargé par le Morey-Holton queue de traction technique. Dans nos mains après 14 jours d'HU, nous avons observé une légère perte (-6,8%) mais non significative de la masse corporelle. Alors Ingalls et al. Ont observé une diminution significative de -12% en poids corporel chez la souris après 14 jours d'HU par la méthode de Morey-Holton 3. Bien Ingalls n'ont pas fait état du poids des surrénales, il semble que notre queue anneau procédé confère moins de stress sur la souris (poids des surrénales chez nos souris HU ne sont pas différents que les contrôles) et un meilleur entretien du poids du corps pendant toute la période hindlimb déchargement.
En résumé, une méthode de l'anneau queue de membre postérieur déchargement a été développé et testé sur des souris HU pour les 14 et 28 jours, et sur des souris retourné à la récupération cage pour 3 jours après HU. Sur la base du poids des surrénales, la masse corporelle et la prise alimentaire, les souris semblent bien adaptés à l'appareil d'arrière-ring. Les membres postérieurs queue bague de déchargement méthode est utile, simple alternative à la technique traditionnelle de Morey-Holton hindlimb déchargement.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Andrew J Dunn, un étudiant de premier cycle de recherche exceptionnels dans notre laboratoire, pour son aide technique et les soins aux animaux. L'Institut National de la Santé et des subventions HD058834 l'Université du Missouri Sciences Life Fellowship financé ce travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wire cutters/pliers | Ace Hardware | 84-056 | |
| Gauze | Fisher Scientific | 22-037-901 | |
| Heating pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Silver nitrate applicators | ARZOL | 0001-2 | |
| Isoflurane,USP | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| Chlorhexidine Gluconate 4% | Purdue Products L.P. | NDC 67618-200-01 | |
| Sterile 2-0 surgical steel suture | Ethicon Inc. | SS-28 | |
| 25 X 5/8 A gauge needle | Terumo Medical Corp. | NN 2516R | |
| Hemostat/ needle holder | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Size 10-24 X 4 machine screws | Hillman The Fastener Center | 90272 | |
| Nylon lock nut size 10 X 24 | Hillman The Fastener Center | 180141 | |
| Wing nut size 10 X 24 | Hillman The Fastener Center | 180243 | |
| Fender Washer size ¼ X 1 | Hillman The Fastener Center | 290012 | |
| Fishing swivel with snap hook size #6, 1-11/16” | Bass Pro Shop | 38-481-554-01 | |
| Metal sewing machine bobbin. | Singer Instruments | 45785 | |
| Paper clip | Office Depot | 221720 | |
| 2” black paper binder clamps. | Office Depot | 308957 | |
| Scotch Multi-Use Duct Tape | Office Depot | 790710 | |
| 1-3/8” Plated slotted steel bar | Home Depot | 548932 | Extends slightly beyond the full length of the cage |
| 50cm X 40cm X 20cm cage (rat cage | Alternative Design Manufacturing | RC88D-PC | |
| Water Bottle | Alternative Design Manufacturing | WB16FS | |
| Stainless Steel wire | Small Parts, Inc. | SWX-4029 | U-shaped wire to support water bottle |
References
- Brown, M., Foley, A. M., Hasser, E. M., Foley, C. M. An alternative method for hindlimb unweighting. J Gravitational Physiol. 12, 43-50 (2005).
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