本文中，我们发现腺相关病毒3型（AAV3）是靶向人肝癌细胞效率最高的载体。
本文内容
摘要
摘要
基于一种非致病性的人细小病毒——腺相关病毒2型（AAV2）开发的重组载体，目前已应用于多项基因治疗的临床试验中。近年来，又分离出多种其他AAV血清型，这些血清型在多种大小动物模型中表现出特定的组织嗜性。1在10种最常用的AAV血清型中，AAV3在转导细胞和组织方面的效率远低于其他类型 体外 以及 体内.
然而，在我们近期发表的研究中，我们已证实AAV3载体能够极其高效地转导人肝癌——肝母细胞瘤（HB）和肝细胞癌（HCC）——的细胞系，因为AAV3在这些细胞中利用人肝细胞生长因子受体作为细胞共受体以实现结合与进入2,3。
本文介绍了利用携带报告基因的重组AAV3载体实现高效转导人肝癌细胞所需的步骤。使用携带治疗基因的重组AAV3载体，最终可能为人类肝癌的潜在基因治疗提供途径。
方案
1. 重组腺相关病毒3型（rAAV3）载体的包装
- 访问网站：“http://www.geguchadze.com/calc”，并计算DNA用量。
- 将质粒pHelper（腺病毒辅助质粒）、pACG2c3（AAV辅助质粒）和pdsAAV-CB-EGFP（rAAV载体）在不含FBS和抗生素的培养基中预先混合。总体积应为8,750 μL，用于十个15 cm2培养皿。
- 直接向第1.2步中的DNA溶液中加入1,250 μL PEI（0.1% m/v，Polysciences，货号#23966，pH 4.5）。涡旋DNA-PEI混合液数秒。
- 在室温（RT）下孵育DNA-PEI溶液5分钟，以形成复合物。
- 每15 cm2培养皿加入1 mL DNA-PEI溶液。
- 转染4小时后，吸除培养基，并更换为25 mL新鲜的含10% FBS的完全培养基（C-DMEM）。
- 转染后72小时，刮取细胞并倒入250 mL锥形离心管中。
- 在4°C下以3000 rpm离心10分钟，弃去上清液。
- 用5 mL RB TMS缓冲液（50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，pH 8.0）重悬细胞沉淀，转移至新的15 mL锥形管中。
- 在干冰-乙醇浴中冷冻10分钟，然后在37°C水浴中解冻10分钟。重复此冻融过程三次。
- 加入1 μL 4.8 M MgCl2和2 μL Benzonase（25 U/μL，Novagen，货号#70664-3）。涡旋混匀后在37°C孵育40分钟。
- 在4°C下以4,000 rpm离心40分钟，收集上清液（澄清裂解物）。
- 在13 mL Quick-Seal离心管（Beckman，货号#342413）中，自上而下依次加入碘克沙醇梯度（OptiPrep，货号#1114542）：2 mL 15%、2 mL 25%、1.5 mL 40%和1.5 mL 60%碘克沙醇。将上清液（第1.12步）加至碘克沙醇梯度顶部，再用RB TMS缓冲液补满离心管。
- 使用Beckman 90Ti转子，在16°C下以75,000 rpm离心1小时。
- 用注射器插入40%-60%界面处，收集40%碘克沙醇组分。
- 将40%碘克沙醇组分转移至一个50 mL锥形管中，并用缓冲液A（20 mM Tris，15 mM NaCl，pH 8.5）定容至40 mL。
- 使用HiTrap Q HP柱（GE Healthcare，货号#17-1154-01）组装过滤装置。依次用以下缓冲液洗涤层析柱：25 mL缓冲液A（20 mM Tris，15 mM NaCl，pH 8.5）；25 mL缓冲液B（10 mM Tris，500 mM NaCl，pH 8.5）；50 mL缓冲液A；40 mL溶于缓冲液A的病毒样品；50 mL缓冲液A（20 mM Tris，15 mM NaCl，pH 8.5）；20 mL缓冲液C（20 mM Tris，175 mM NaCl，pH 8.5）；
- 将缓冲液C组分收集至20 mL Apollo浓缩管（Orbital Biosciences）中，在4°C下以3,000 rpm离心10分钟。
- 弃去滤过液，加入20 mL预冷的PBS，再次在4°C下以3,000 rpm离心10分钟。
- 弃去滤过液，加入500 μL预冷的PBS，将载体从膜上洗脱下来，转移至硅化处理的Eppendorf管中，分装后于-80°C冷冻保存。
2. rAAV3 载体滴度的测定
- 在冰上融化一个 Eppendorf 管中的 10 μL 纯化病毒，加入 40 μL ddH2O。
- 加入 0.2 μL 苯并核酸酶（Benzonase，25 U/μL，Novagen，货号# 70664），37°C 孵育 1 小时。
- 在另一个 Eppendorf 管中取 50 μL 质粒标准品（0.2 ng/μL）。
- 在每个管中加入 50 μL 100 mM NaOH，65°C 孵育 30 分钟。
- 立即在冰上冷却至少 5 分钟。
- 根据 Bio-Dot 滤纸（Bio-Rad，货号# 1620161）裁剪转移膜（Millipore，货号# INYC00010）。用三张滤纸在 10x SSC 中冲洗膜 20 分钟。
- 安装槽印迹 SF 装置（Bio-Dot，货号# 170-6542），连接至真空瓶，并向槽印迹装置中加入 100 μL 10x SSC。
- 向第 2.5 步中的每个样品中加入 100 μL 20x SSC 和 1 μL 6x 上样染料。
- 将每个样品的 100 μL 加载到槽印迹装置中的膜上。
- 向每个样品中再加入 100 μL 10x SSC。
- 重复步骤 2.9 和 2.10，直至所有样品完全通过膜。
- 拆卸槽印迹装置并取出膜，将其放入 Inspector Linker SL-1000 紫外交联仪中。打开“Energy”和“Optimal Crosslink”（显示为 1200），然后按下“Start”。
- 将 1 mL 鲑鱼精（SS）DNA（Fisher，货号# NC9753983）煮沸 5 分钟，在冰上冷却至少 5 分钟。
- 通过混合以下组分配制预杂交液：27.5 mL ddH2O、15 mL 20x SSC、5 mL 50x Denhardt 溶液、1.25 mL 20% SDS、0.25 mL PolyA 和 1 mL 第 2.13 步中的 SS DNA。
- 将膜悬浮于 25 mL 预杂交液中，置于带盖玻璃缸内，在 65°C 杂交仪中过夜孵育。
- 将 50 ng DNA 模板稀释于 10 μL ddH2O 中，100°C 煮沸 5 分钟，立即在冰上冷却至少 5 分钟。
- 室温下以 3,000 rpm 离心 1 分钟，加入 2 μL 10 mM 3 dNTPs（不含 dCTP）、2 μL 六核苷酸混合物（Roche，货号# 11277081001）、1 μL Klenow 酶（Roche，货号# 11008404001）和 5 μL α-32P-dCTP，37°C 孵育 10 分钟。
- 将 G-50 柱（GE Healthcare，货号# 27-5330-01）以 3,000 rpm 离心 2 分钟，将第 2.17 步中的探针加入柱中，再以 3,000 rpm 离心 2 分钟，收集流出液。
- 测定放射活性。将探针在 100°C 煮沸 5 分钟，立即在冰上冷却至少 5 分钟。
- 将探针（6×105 cpm/mL）加入含有膜的预杂交液中。
- 在 65°C 杂交仪中过夜孵育。
- 弃去杂交液，在室温下用 2x SSC + 0.1% SDS 溶液冲洗膜 15 分钟。
- 弃去溶液，在 65°C 下用 0.1x SSC + 0.1% SDS 溶液冲洗膜 30 分钟。
- 弃去溶液，在室温下用 0.1x SSC 溶液短暂冲洗膜。
- 在 -80°C 曝光 6 小时并显影胶片。典型结果如图 1 所示。
3. 人肝癌细胞中rAAV3载体介导的转导与外源基因表达
- 在96孔板的每个孔中接种1×104个细胞（Huh7或Hep293TT细胞均可）。在加湿的CO2培养箱中孵育至少18小时。
- 从96孔板中移除培养基。
- 用不含FBS和抗生素的培养基各50 μL洗涤细胞两次，并移除洗涤液。
- 每孔加入50 μL不含FBS和抗生素的培养基，并加入rAAV载体，感染复数为5,000 vgs/细胞。
- 将培养板置于CO2培养箱中孵育4小时。
- 弃去培养基。用50 μL完全培养基洗涤细胞两次，并移除洗涤液。
- 每孔加入150 μL C-DMEM，将培养板置于CO2培养箱中继续孵育72小时，然后使用荧光显微镜（DMI 4000B；Leica Microsystems）观察EGFP表达情况。
- 通过ImageJ分析软件（NIH，Bethesda，MD，USA）对病毒感染细胞三个孔的图像进行定量分析。
- 转基因表达水平以每个视野中绿色荧光的总面积（像素2）来评估。典型结果如图2所示。
- 转基因表达也可通过流式细胞术进行测定。
4. 代表性结果：
按照上述方案，可高效地制备腺相关病毒（AAV）血清型载体。典型产量约为 500 μL，包含约 1011 vgs/μL 的纯化载体原液。通过定量 DNA 点印迹法比较经与未经苯甲酸酶（Benzonase）消化的杂交信号，可确定载体原液的纯度。纯化的 rAAV3 载体可高效转导人肝癌——肝母细胞瘤（HB）和肝细胞癌（HCC）——细胞系。
图 1. 用于测定 rAAV3 载体滴度的定量 DNA 槽印迹分析。将经苯并核酸酶消化的纯化病毒储备液进行两倍系列稀释（上排），并通过32P 标记的 EGFP 特异性 DNA 探针进行定量 DNA 槽印迹分析。AAV3 载体的滴度通过与膜上加载的 1 ng（中排）或 10 ng（下排）AAV-EGFP 质粒标准品比较确定。数字对应 DNA 拷贝数。
图2. 重组腺相关病毒载体介导的外源基因在人肝癌细胞中的表达。Hep293TT细胞是一种 recently established human hepatoblastoma cell line4，分别进行空白感染（左图），或在37°C条件下用5,000 vgs/细胞的scAAV2-EGFP或scAAV3-EGFP载体转导2小时。转导后72小时，使用荧光显微镜观察外源基因的表达情况。
讨论
基于一种非致病性人类细小病毒——腺相关病毒（AAV）的重组载体已被开发，并正用于多项基因治疗的临床试验5此前，在10种最常用的AAV血清型中，AAV3载体的转导效率总体上被报道为特别低，无论是在 体外 和 体内1然而，我们最近观察到，通过流式细胞术进行定量分析，AAV3 载体对人肝癌细胞系的转导效率非常高2，并且AAV3利用人肝细胞生长因子受体（hHGFR）作为这些细胞中的细胞共受体以介导结合与入侵3强烈提示 AAV3 对人肝细胞具有选择性嗜性，尤其对人肝癌细胞具有明显趋向性。然而，由于 AAV3 载体也能高效转导正常人肝细胞2在癌症基因治疗应用中的潜在用途 体内 将受到负面影响。一种可能的策略是通过鉴定肿瘤细胞特异性产生而正常肝细胞不产生的基因产物，实现对癌细胞的转录靶向。例如，先前的研究表明，甲胎蛋白（α-fetoprotein, AFP）的血清水平可作为特异性标志物，用于监测某些类型肝癌的存在、进展和/或复发，因为正常肝细胞通常仅产生极少量的这种蛋白。事实上，我们已使用携带AFP启动子的AAV3载体，在肝癌细胞中靶向表达转基因，而在正常肝细胞中则不表达。2，目前正在进行研究以测试该方法在肝癌小鼠异种移植模型中的有效性。在我们的其他研究中，我们观察到通过定点突变病毒衣壳表面暴露的酪氨酸残基，可显著提高多种AAV血清型载体的转导效率6-14由于AAV3中7个表面暴露的酪氨酸残基中有6个也是保守的，我们对这些位点进行了定点突变，并观察到酪氨酸突变型AAV3载体在人肝癌细胞中的转导效率显著提高（未发表数据）。目前还正在进行相关研究，以评估酪氨酸突变型AAV3载体在人肝母细胞瘤和肝细胞癌小鼠异种移植模型中的安全性和有效性；若结果理想，最优的酪氨酸突变型AAV3血清型载体有望用于靶向人肝癌的潜在基因治疗。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢 R. Jude Samulski 博士和 Xiao Xiao 博士慷慨赠送的重组 AAV3 和 AAV-EGFP 质粒，以及 Gail Tomlinson 博士慷慨提供的 Hep293TT 细胞。本研究部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目包括公共卫生服务基金 R01 HL-076901、R01 HL-097088 和 P01 DK-058327（项目 1）（资助对象：AS）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Cellgro | 10-0170CM | |
| PEI | Polysciences, Inc. | 23966 | |
| 苯甲酸酶 | Novagen, EMD Millipore | 70664-3 | |
| HiTrap Q HP 柱 | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
| 鲑鱼精子 DNA | Fisher Scientific | NC9753983 | |
| 碘克沙醇梯度 | OptiPrep | 1114542 | |
| G-50 柱 | GE Healthcare | 27-5330-01 |
参考文献
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