在本视频中，我们演示了使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）进行软光刻的技术，该技术用于制备用于培养神经元的微流控装置。
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摘要
摘要
在本视频中，我们演示了使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）进行软光刻的技术，该技术用于构建用于培养神经元的微流控装置。此前，已使用SU-8和光刻技术在硅晶圆上制备出神经元微流控装置的设计图案，从而制作出主模具，我们简称为“主模”。接下来，将硅聚合物PDMS浇注在主模表面，然后在80°C下加热1小时使其固化。PDMS由此形成装置的负模。随后小心地将PDMS从主模上切割并剥离下来。在储液池位置打孔，并将装置周围多余的PDMS修剪干净。使用氮气吹除装置表面的任何多余碎屑。此时，装置已准备就绪，可通过等离子灭菌/清洁仪将其与Corning No. 1 盖玻片永久键合，也可通过直接将装置放置在盖玻片上来实现可逆性结合。装置与玻璃的可逆性结合在另一视频中有专门介绍，且需先使用70%乙醇或高压灭菌法对装置进行灭菌处理。等离子处理本身具有灭菌作用，因此无需进一步处理。然而，在进行等离子处理时需注意：必须在处理后10分钟内向装置中加入液体，以确保表面仍保持亲水性。若超过10分钟再加液，液体将难以进入装置内部。神经元培养装置通常采用等离子键合方式固定于盖玻片上，并立即向装置中加入pH 8.5硼酸盐缓冲液配制的0.5 mg/ml多聚-L-赖氨酸（PLL）。PLL孵育时间至少为3小时，期间用去离子水（dH₂O）清洗装置，清洗次数不少于3次，每次间隔至少15分钟。随后吸除水分，并向装置中加入新鲜培养基。此时装置即可投入使用。需要注意的是，切勿将装置中的培养基完全移除，主通道中应始终保留一定量的培养基。
方案
第1部分：微流控神经元装置的制备
- A 使用通过光刻技术在3英寸硅片上制备的SU-8图案来浇铸聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控模具。我们将带有SU-8图案的硅片称为母模，或“master”。
- PDMS 与固化剂按 10:1 的质量比（w/w）混合，即每 10 克 PDMS 加入 1 克固化剂。
- 将PDMS充分混合后倒入硅晶圆上。硅晶圆置于一个10 cm的聚苯乙烯培养皿中。覆盖模具并形成约4 mm厚度，大约需要12 g至15 g的PDMS。
- 将带有PDMS的模具放入真空干燥器中，培养皿盖子打开，施加真空。此步骤旨在帮助去除在搅拌固化剂过程中引入PDMS中的气泡。 去除气泡大约需要15分钟。
- 将带有PDMS的模具从干燥器中取出。使用带有0.45 μm滤膜的气枪去除任何残留的气泡。
- 将模具置于80°C的加热板上固化1小时。
注意：如果无真空干燥器，可将模具在室温下静置数小时，气泡最终会自行消失。若无加热板，PDMS 在室温下24小时后也可固化。
注意：在固化过程中，还需确保模具处于水平状态。
第二部分：切割神经元微流控装置
- PDMS在模具上固化后，将其转移至洁净工作台。
- 使用手术刀沿器件边缘切割出一个圆形。当将刀片插入PDMS时，应注意与硅晶圆接触，但切勿对晶圆施加过大压力，否则会导致模具破裂。
- 在器件周围完成整圈切割后（每个3英寸硅模具上包含4个器件），小心地将PDMS从模具上剥离。可通过将手术刀插入先前切口并轻轻扭转来开始剥离过程。
- 接下来，使用8 mm组织活检打孔器在器件上打出储液孔。
- 随后将器件切成四份，并修剪掉多余的PDMS，以便器件能够整齐地贴合于Corning盖玻片（No. 1，24 mm × 40 mm）上。使用氮气吹除所有多余碎屑。顽固残留物也可用3M Scotch Brand 471乙烯基胶带去除。
第3部分：将装置与玻璃盖玻片进行等离子键合。
- 使用等离子清洗机将Harrick神经器件与盖玻片进行键合。简而言之，将器件放入等离子清洗机中，并使用真空泵抽去腔室内的空气。
- 当真空压力达到300毫托（milliTorr）后，接通电感线圈电源并调至高功率。
- 电感线圈利用腔室内残留的空气分子产生等离子体——“一种由电子、离子以及中性原子或分子组成的部分电离气体”——http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php。等离子体在玻璃和器件表面产生活性基团，当两者接触时可形成永久性键合。等离子体还可使表面变为亲水性，有助于液体的加入。此外，等离子清洗机能对器件进行灭菌。
将含有微流控结构的PDMS器件表面朝上，与玻璃载片一同放入等离子清洗机中。
在洁净台中将经等离子处理的玻璃和微流控器件表面相互贴合 ，然后置于无菌的60 mm培养皿中。处理后的表面会形成紧密且不可逆的键合。 - 在等离子体键合完成后的10分钟内，向器件中加入多聚-L-赖氨酸（Poly-L-Lysine, PLL）。10分钟后，器件表面的亲水性会逐渐下降，导致PLL难以进入器件内部。
注意：加入PLL后需仔细检查器件中是否存在气泡。主通道中的气泡应避免，因为其可能导致细胞氧化。去除气泡的一种简便方法是：使用P200移液器吸取150 µL液体（本例中为PLL），将枪头直接对准主通道入口，用力下压排出液体。此操作可能需要重复数次，但最终移液器产生的压力将驱除气泡。 - 加入PLL的器件在标准组织培养孵箱中37°C、5% CO2条件下孵育过夜。
- 次日，用高压灭菌的dH2O快速冲洗器件两次。在此过程中，主通道内的液体不得完全排空，仅可从储液池中移除液体。若主通道排空，将引入气泡。完成两次快速冲洗后，器件中重新充满高压灭菌的dH2O，并放回孵箱中至少静置3小时，或过夜。
- 再下一日，再次用高压灭菌的dH2O快速冲洗器件两次。随后向器件中加入含B27和GlutaMax等必要添加剂的神经基础培养基，用于原代大鼠神经元的培养。将器件重新放回孵箱中备用。此时器件已准备就绪，可用于神经元接种。
讨论
在本视频中，我们演示了如何制作和准备一种用于培养神经元的PDMS微流控装置。该装置通过微沟道将含有细胞体、树突和轴突混合物的区域与纯轴突区域分隔开，从而获得纯净的轴突组分。这些装置使研究人员能够研究各种处理方法的影响，并提供一个平台，用于对轴突施加物理损伤，进而观察这些处理对神经元产生的效应。此外，该装置在神经元培养中提供了有序性，有助于运输研究的开展。同时，分隔细胞培养区与轴突区的微沟道实现了两个区域之间的流体隔离，使得可以对装置的一侧进行处理，而不会将处理物质直接作用于另一侧。这一特性使研究人员能够研究由处理引发的信号转导和物质运输等效应。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| PDMS | 试剂 | Dow Corning | Sylgard 184 及固化剂。请咨询 Dow Corning 以查找您附近的供应商 | |
| 等离子清洗仪 | 工具 | Harrick Scientific Products, Inc. | http://www.harrickplasma.com/ | |
| 神经基础培养基 | 试剂 | Invitrogen | 21103-049 | 神经基础培养基由 Invitrogen 公司在其 Gibco 细胞培养试剂系列中提供。 |
| B27 | 试剂 | Invitrogen | 17504-044 | B27 是 Invitrogen 公司在其 Gibco 细胞培养试剂系列中提供的专有添加剂。 |
| Glutamax | 试剂 | Invitrogen | 35050-061 | Glutamax 由 Invitrogen 公司在其 Gibco 细胞培养试剂系列中提供。 |
| Corning No. 1 盖玻片 | 盖玻片 | Corning | Corning No. X2935 244 | 可通过 Fisher Scientific 购买，Fisher 目录编号 12-531D |
| 60 mm 培养皿 | 工具 | Fisher Scientific | 08-757-13A | 使用 60 mm 聚苯乙烯无菌培养皿来承载固定在玻璃上的装置。 |
| BD Falcon 50 ml 离心管 | 工具 | BD Biosciences | Falcon No. 352098 | 可通过 Fisher Scientific 目录编号 14-959-49A 购买 |
| BD Falcon 15 ml 离心管 | 工具 | BD Biosciences | Falcon No. 352097 | 可通过 Fisher Scientific 目录编号 14-959-70C 购买 |
| Poly-L-Lysine | 试剂 | Sigma-Aldrich | P-1274 | |
| 新项目 |
参考文献
- Park, J. W., Vahidi, B., , A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
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