利用MG53介导的细胞膜修复可视化 体内 和 体外 系统

摘要

本文描述了用于在整体动物和细胞水平上可视化MG53介导的细胞膜修复动态过程的实验方案。这些方法可用于研究质膜再封闭的细胞生物学及再生医学。

摘要

细胞膜急性损伤的修复是正常细胞生理学中的基本过程，而细胞膜修复功能缺陷与多种退行性疾病相关。近期发现MG53是膜再封闭机制中的关键组分，这不仅有助于深入理解组织修复的基本生物学机制，也为再生医学中的转化应用提供了可能。本文详细描述了利用小鼠模型进行跑台运动实验以探究MG53在肌肉损伤修复中的in vivo功能、通过检测染料进入分离的肌纤维来评估ex vivo膜修复能力，以及利用活细胞共聚焦显微镜观察MG53介导的囊泡运输与细胞膜修复动态过程的实验方案。

方案

1. 跑台运动用于揭示小鼠模型中肌肉损伤的程度

1. 设定跑步机在跑步方案中使用的表面角度。通常使用水平平面或-7°至-15°的下坡角度，也可使用上坡角度。部分跑步机自带调节倾斜角度的装置，而其他跑步机则需通过外部方式抬高设备来实现角度调整。
2. 在将动物放入跑步机前，在跑步机下方放置托盘或蓝色实验垫，以收集动物在跑步过程中产生的排泄物。
3. 在跑步前，应使小鼠适应跑步机环境。具体操作是将动物放入跑步机中15分钟，期间关闭电刺激网格，开启传送带驱动电机但不使传送带移动（即速度设为0 m/s）。
4. 开启激励用的电刺激网格。电刺激脉冲的强度和频率通常可在跑步机上进行调节，但不同厂家的设备参数设置可能有所不同。通常无需使用最大强度即可激励小鼠奔跑，而较高的频率（至少每两秒一次）有助于提高动物的配合度。
5. 启动跑步机传送带以开始跑步方案。初始速度建议设为约5米/分钟，作为小鼠的热身阶段。随后可逐步加速，通常每分钟增加1–2米/分钟。
6. 在正式实验性跑步开始前，通过在热身速度下进行一系列短时跑步（5分钟），持续3至10天，通常可提高动物在多数方案中的配合度。
7. 急性力竭运动通常涉及随时间逐步提高跑步机速度，直至达到并维持最大速度（一般<30 m/m），直到小鼠出现力竭迹象。判断力竭的标准有所不同，但通常包括小鼠在电刺激网格上停留时间超过总时间的一半，或连续5秒停留在电刺激网格上且未返回跑步带表面。一旦某只小鼠力竭，即可将其从跑步机上移出，并记录其总跑步时间。
8. 在急性跑步实验中，可通过改变跑步机角度来增加运动负荷（使用上坡角度）或诱导产生破坏性的离心收缩（使用下坡角度），后者可导致肌纤维肌膜撕裂¹。在实施此类操作前，可向动物注射伊文思蓝染料（Evans blue dye），作为组织学染色剂用于识别受损的肌纤维^2,3。
9. 耐力训练跑步方案旨在长时间（可达数月）对动物施加运动负荷，以诱导肌肉或心血管系统的结构重塑。热身程序与上述相同（步骤1.5），但最大速度通常较低，且跑步时间可能较长（>1小时）。
10. 跑步结束后，可将小鼠放回笼中。跑步机在使用过程中通常会变得非常脏，尤其是在长时间的实验后。每次使用后必须对跑步机进行清洁，通常使用70%乙醇喷雾进行消毒。

2. 离体 UV激光损伤后分离肌纤维膜修复能力的检测

1. 从小鼠足部解离出趾短屈肌（flexor digitorum brevis, FDB）的浅层组织。首先沿足底中线切开皮肤，注意不要损伤下方的肌肉；然后做横向切口并去除皮肤。可见FDB肌的扁平白色肌腱（近端肌腱）附着于跟骨。用镊子钝性分离该肌腱，并在靠近附着点处将其切断；用镊子夹住游离的肌腱，轻轻上提以分离FDB肌与周围组织，同时剪断仍相连的结缔组织。当观察到远端肌腱分支至各个脚趾时，可在这些肌腱连接至深层肌肉的位置进行切断，从而完整移除FDB肌。
2. 将FDB肌组织束放入装有1 ml预热至37°C胶原酶溶液的1.5 ml离心管中，将离心管水平固定于37°C摇床内，在200 rpm条件下振荡65分钟。孵育时间可能需要调整，以确保充分消化，表现为肌肉外观呈松散 fray 状态且颜色变浅。
3. 使用剪去末端、口径足够大以使消化后的组织束顺利通过而不受损的1 ml移液枪头，小心地将消化后的FDB肌束转移至含有约600 μl含2.5 Ca²⁺的Tyrode溶液的1.5 ml离心管中。轻轻翻转离心管，使肌纤维从组织束中松散释放。
4. 将一个30 μL移液枪头剪裁至其内径略小于肌束直径（约15–20 μm）。使用移液器轻柔地将肌束吸入枪头，再缓慢推回溶液中。重复此操作，直至大多数单根肌纤维从组织束中分离。
5. 通过轻柔翻转离心管使分离的肌纤维充分混匀，取适量悬液滴加至玻璃底培养皿（delta T dish）中。加样体积取决于分离效率及特定实验方案所需的有效纤维数量。剩余纤维可在4°C条件下保存于离心管中，用于后续约6小时内的其他实验。
6. 将培养皿静置5分钟，避免扰动，使肌纤维充分贴附于玻璃底部。
7. 将玻璃底培养皿置于配备紫外激光器的共聚焦显微镜上。在相差显微镜下以>100倍放大倍率观察肌纤维，检查其是否具有正常的横纹结构以及笔直的杆状形态。
8. 向溶液中加入FM1-43或FM4-64苯乙烯吡啶染料⁴，终浓度为2.5 μM⁵。
9. 为诱导肌纤维损伤，将目标纤维置于成像视野中，使其方向从视野左上角至右下角呈45°角排列（图1）。使用紫外激光（80 mW或更高，351/364 nm）以最大功率照射质膜上5×5像素区域（约0.9 μm×0.9 μm），持续5秒。照射区域应横跨质膜边界，即5×5像素方框的一半位于肌纤维内部，另一半位于外部（图1）。
10. 每隔5秒采集一次染料进入肌纤维的图像，持续最多5分钟。
11. 每张培养皿中最多重复步骤2.8三次，因荧光染料最终会被肌纤维内吞，干扰数据分析。完成三根纤维后，应从步骤2.5开始制备新的培养皿。
12. 通过计算各帧图像间荧光强度变化（ΔF/F₀）来分析染料摄入量。需使用ImageJ等公开可用的图像分析软件（http://rsbweb.nih.gov/ij/），测量约200 μm²区域的平均荧光强度。为比较不同纤维间的染料摄入情况，应对每帧图像进行如下计算：ΔF/F₀，其中F₀为第一帧图像（t = 0，损伤前）感兴趣区域的平均荧光强度，ΔF为后续各帧荧光强度的变化值（F−F₀）。

3. 活细胞共聚焦成像以监测细胞膜修复的动态过程

1. 微量移液管由 PYREX 毛细管制成。将毛细管置于微量移液管拉制仪上，使用预设程序进行拉制（加热=695；拉力=50；速度=55；时间=250）。
2. 将微量移液管连接至三轴（xyz）显微操作器。
3. 使用常规方法在玻璃底 delta T 培养皿上对细胞进行质粒 DNA 转染。实验开始前，应将培养基更换为含 2.5 mM Ca²⁺ 的 Tyrode 缓冲液。
4. 将含有转染细胞的玻璃培养皿置于激光扫描共聚焦显微镜下，使用 40 倍、1.3 数值孔径的油浸物镜进行观察。
5. 通过将微量移液管插入细胞膜后迅速抽出，以实现急性活细胞损伤^3,6。连续活细胞图像以每帧 1.54 秒的时间间隔采集。
6. 对于皂苷诱导的膜破坏实验，使用重力驱动的自行组装灌流系统灌注含 0.005% 皂苷（Sigma）的 2.5 mM Ca²⁺ Tyrode 缓冲液⁷。灌流速率约为 1 ml/min，灌流管尖端应直接置于待成像细胞上方。

4. 代表性结果：

在拍摄过程中可以制作小鼠跑台运动的代表性视频。该视频将展示由于骨骼肌损伤导致mg53-/-小鼠的跑步能力下降。

上述紫外激光损伤方案所造成的损伤程度取决于所分析肌纤维的膜修复能力。这种能力受到肌纤维来源小鼠基因型、细胞外环境以及蛋白质表达改变（转染或感染）的影响。正常的野生型肌纤维会表现出轻度至中度的染料进入（图2a）。而来自膜修复能力受损的mg53-/-小鼠的肌纤维则会显示染料更显著地进入纤维内部（图2b）。

微电极损伤的典型结果表明，含MG53的囊泡会转位至损伤部位。图3a和3b显示了通过将微移液管插入细胞膜造成损伤的GFP-MG53转染C2C12成肌细胞。在微移液管造成损伤前，GFP-MG53位于细胞质膜和细胞质中³。微移液管穿刺后，含GFP-MG53的囊泡向损伤部位移动（如箭头所示）。图3c显示经0.005%皂苷处理的GFP-MG53转染C2C12成肌细胞，皂苷是一种可使质膜通透化的去垢剂。经皂苷处理后，GFP-MG53从细胞质转位至细胞膜。

Weisleder, et al. 图1. 肌纤维排列及损伤区域定义。 展示了分离的肌纤维在视野中的正确取向以及损伤区域的界定。

Weisleder 等，图2。FDB 肌纤维的紫外激光损伤。 图像显示损伤前（0秒，左侧）和损伤后200秒（右侧）的肌纤维。来自野生型小鼠的肌纤维（a）显示轻微损伤；而来自细胞膜修复功能受损小鼠的肌纤维（b）允许更多染料进入。

Weisleder 等，图3. 微电极和皂苷对培养细胞造成的损伤。 图像显示了C2C12成肌细胞（a, b）和一个C2C12成肌母细胞（c）在损伤前（上方）和损伤后（下方）的情况。使用微电极造成损伤的细胞（a, b）显示MG53向损伤部位转位（箭头所示）。经皂苷处理的细胞（c）显示MG53向细胞膜转位。

讨论

跑台跑步是一种对实验动物施加运动负荷的有效方法。作为一种测量肌肉功能或耐力的方法，该技术的信噪比较低，难以以一致且可重复的方式实施⁸。通常，力竭时间可作为终点指标，用于检测实验组之间的显著差异，例如某些基因敲除小鼠品系与野生型小鼠之间的差异⁹。然而，对于产生较细微差异的实验干预（如某些药物试验），该技术的背景噪声可能掩盖组间差异。为了最大限度地提高该方法的可重复性和敏感性，必须严格保持每次实验条件的一致性。动物运动的时间以及热身阶段的条件均为重要影响因素，应在各次试验中保持恒定。

品系差异可能对跑步机实验方案的设计产生显著影响，因为某些小鼠品系在跑步机上的持续奔跑时间明显长于其他品系，并且对耐力运动的反应也不同¹⁰。一般而言，在力竭实验中，多数小鼠能够在跑步机速度持续增加的条件下（起始速度为5 m/min，之后每分钟增加1 m/min）累计奔跑200–300米。对于耐力运动训练，可让小鼠以9–12 m/min的速度每周进行2至3次、每次30分钟的跑步。然而，具体研究通常需要对实验方案进行一定优化，以满足特定的实验需求。

UV激光损伤方法已被证明是测量骨骼肌纤维膜修复能力的有效手段^3,6,11。此类实验成功的关键要素之一是仅选用呈笔直杆状、横纹排列规则且肌膜表面光滑无皱褶的肌纤维。若选择其他类型的肌纤维，可能其本身已存在膜损伤，从而干扰实验结果的解读。此外，肌纤维的取向及照射区域的界定应如图1所示。这可确保产生大小可重复的损伤，从而实现不同肌纤维间的比较。若定义的损伤区域完全位于肌纤维内部，则将形成内部损伤，而非破坏肌膜。另外，所计算的ΔF/F₀值对用于测量平均荧光强度的感兴趣区域（ROI）选择极为敏感。一个约200μm²、紧邻并包含损伤部位的区域是合适的。与定义的损伤区域不同，该区域应完全位于肌纤维内部。若将纤维外部空间纳入其中，则会导致在染料摄入较少的纤维中ΔF/F₀升高，而在表型更严重的纤维中ΔF/F₀降低。这会降低检测的灵敏度，从而使不同肌纤维之间的比较更加困难。

在微移液管损伤实验中，微移液管与玻璃底培养皿之间的角度应约为45度，以便有效损伤细胞膜。应选择牢固贴附在培养皿底部的细胞进行微移液管损伤，不应使用圆形细胞，因为它们在微移液管穿刺后很可能脱落。与微移液管穿刺实验相比，皂苷透化实验技术要求较低，操作相对更快。然而，皂苷损伤存在若干局限性，例如每个培养皿只能使用一个细胞，因为皂苷会扩散并对该培养皿中的其他细胞造成损伤。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
啮齿类动物跑步机	Columbus Instruments Exer 3/6 或同类产品
70% 乙醇	ISC Bioexpress
解剖工具，包括尖头镊子、弹簧剪刀	World Precision Instruments, Inc.
2 mg/ml I型胶原酶	Sigma-Aldrich
无 Ca2+ Tyrode 缓冲液（140 mM NaCl，5 mM KCl，10 mM HEPES，2 mM MgCl2，pH 7.2，290 mosm）	Sigma-Aldrich
2.5 mM Ca2+ Tyrode 缓冲液（140 mM NaCl，2.5 mM CaCl2，5 mM KCl，10 mM HEPES，2 mM MgCl2，pH 7.2，290 mosm）	Sigma-Aldrich
温度可控轨道摇床	New Brunswick Scientific
Delta TPG 培养皿	Fisher Scientific	1207133
配备 Enterprise 80 mW 紫外激光器的 LSM 510 共聚焦显微镜或同类共聚焦显微镜	Carl Zeiss, Inc.
FM1-43 或 FM4-64 染料	Invitrogen
硼硅酸盐毛细管，规格 0.8-1.0 × 100 mm	PYREX	部件号 9530-2
微电极拉制仪	Sutter Instrument Co.	型号 P-97
三轴显微操作器	Narishige International	MHW-3
Radiance 2100 激光扫描共聚焦显微镜或同类显微镜	Bio-Rad	MHW-3
皂苷	Sigma-Aldrich	47036