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RNA病毒保真性变异体的分离及病毒突变频率的表征

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DOI：

10.3791/2953

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2011年6月16日

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1Viral Populations and Pathogenesis lab and CNRS 3015, Institut Pasteur

本文内容

摘要

本文描述了分离和鉴定RNA病毒RNA聚合酶保真性变异体所需的步骤，以及如何利用突变频率数据在组织培养中确认保真性的改变。

摘要

RNA病毒利用依赖RNA的RNA聚合酶复制其基因组。这些酶固有的高错误率是产生极高种群多样性的主要原因之一，从而促进病毒的适应与进化。越来越多的证据表明，通过病毒聚合酶中细微的氨基酸改变，可以调节RNA病毒的内在错误率及其相应的突变频率。尽管已有部分病毒RNA聚合酶的生化检测方法可用于定量测定其保真度，但本文描述了一种测量RNA病毒突变频率的简单方法，该方法在识别影响保真度的突变方面已被证明与生化方法同样准确。该方法采用常规的病毒学和测序技术，可在大多数生物学实验室中完成。根据我们对多种不同病毒的研究经验，我们确定了若干关键步骤，需对其进行优化，以提高分离出保真度变异体的可能性，并获得具有统计学意义的数据。分离和表征影响保真度的突变可为聚合酶的结构与功能提供新的见解1-3。此外，这些保真度变异体还可作为有力工具，用于研究病毒适应与进化机制4-7。

方案

1. 确定对细胞最小毒性的诱变剂浓度范围

本实验的目的是确定在感染过程中可使用且不会引起过度细胞毒性的诱变剂浓度范围。本质上，您需要模拟病毒侵染所需的条件。对于大多数病毒，侵染过程持续2至7天。请准备足够数量的培养板，以便在每一天取样检测细胞。若使用非贴壁细胞，需相应调整实验方案。

  1. 实验前一天，在6孔板中每孔接种7 × 105个HeLa细胞，使细胞在实验当天达到亚融合状态（75%融合度）的单层。每孔将用不同浓度的诱变剂处理，共可设置6个浓度梯度。
  2. 实验当天，用组织培养基配制诱变剂的系列稀释液。对于HeLa细胞，碱基类似物（利巴韦林、5-氟尿嘧啶、5-氮杂胞苷）使用0至1000 μM的浓度范围，MgCl2使用0至50 mM，MnCl2使用0至5 mM。
  3. 吸除各孔中的培养基，每孔加入2 ml含诱变剂的培养基，放回培养箱继续培养。
  4. 每隔24小时，取一孔细胞检测细胞活力。可通过台盼蓝染色法或商业化荧光/发光检测试剂盒（如Promega的CellTiter-Glo® 发光细胞活力检测试剂盒）完成。
  5. 进行台盼蓝排染染色时，将一组处理不同浓度诱变剂的细胞从培养板上消化下来，并通过离心轻轻收集细胞沉淀。
  6. 弃去上清液，用PBS重悬细胞（血清可能干扰染色效果）。
  7. 取1体积PBS重悬的细胞悬液与1体积0.4%台盼蓝溶液混合，室温孵育2分钟。
  8. 使用血细胞计数板分别计数活细胞（未染色）和死细胞（蓝色染色）的数量。计算每个诱变剂浓度下（包括未处理对照组）的活细胞百分比。我们发现，在感染终点（病毒滴度达到最高时）导致细胞死亡率低于50%的条件，最适合用于筛选诱变剂抗性突变体。

2. 确定最佳的无毒突变剂浓度，该浓度可适度降低病毒滴度（约降低 0.5–2 个对数级）

本实验旨在确定能够施加较强选择压力但又不会对群体过度诱变的诱变剂浓度。对于RNA诱变剂，我们发现这对应于病毒滴度降低10.5至2个对数级。在此浓度下，每个基因组至少在一个或两个位点发生突变。诱变剂可能有助于耐药突变的产生，随后在传代过程中被筛选出来。若引入过多突变（在极高诱变剂浓度下），携带耐药突变的病毒本身也会因致死性诱变而难以分离。

  1. 使用与步骤1相同的条件在培养板中接种细胞
  2. 在实验当天，用组织培养基配制诱变剂的稀释液。使用之前确定的相同浓度范围，但排除导致超过50%细胞死亡的浓度。每孔需准备足够的培养基以覆盖两次（每孔4 ml），以便在感染前对细胞进行各浓度诱变剂的预处理
  3. 吸除培养基，加入含诱变剂的培养基，37℃孵育2小时以预处理细胞。对于大多数细胞类型，此时间足以完成诱变剂的摄取
  4. 移除培养基，以低感染复数（MOI为0.1或0.01）在最小体积（6孔板每孔200 μl）中接种病毒。孵育15–60分钟，使病毒侵染细胞。定期轻轻摇动培养板，确保接种物均匀覆盖细胞单层
  5. 吸除接种的病毒液，用2 ml PBS洗涤两次，尽可能去除残留的接种物
  6. 向每孔加入含相应浓度诱变剂的培养基，继续培养细胞，时间相当于病毒完成3–6个复制周期
  7. 收集每孔中的病毒，测定诱变剂对病毒滴度的抗病毒效应。可通过标准蚀斑实验或有限稀释法（TCID50）进行检测。注意：仅检测RNA合成水平的技术可能不适用，因为无法有效反映诱变效应。例如，经诱变后含有致死性突变的病毒基因组仍可能在qRT-PCR中被检出，但在病毒活性检测中则无法观察到
  8. 根据计算所得的病毒滴度，确定能使病毒滴度较未处理对照组降低10.5–2个对数级，且对细胞毒性较低（理想情况下细胞毒性低于50%）的诱变剂浓度

3. 诱变抗性变异体的分离与鉴定

在上述确定的最佳诱变剂浓度下进行大种群规模的连续传代，并检测整个传代过程中病毒滴度的变化。作为对照，将病毒在不含任何诱变剂的生长培养基中进行传代。作为另一对照以监测缺陷型干扰颗粒（DI）可能的出现，需在每次传代时进行不含诱变剂的新鲜感染（未传代对照）。

  1. 感染前一天，将 1.5 × 106 个 HeLa 细胞接种于 25 cm2 培养瓶中（也可使用其他规格的培养瓶），以获得次日生长至亚汇合状态的单层细胞。
  2. 感染当天，用含有第 2 节中确定的最佳浓度每种诱变剂的培养基对细胞进行预处理，处理时间为 2 小时。
  3. 移除培养基，用最小体积的病毒接种液以 MOI 为 1 或不会导致所研究病毒产生缺陷性干扰（DI）颗粒的最高 MOI 值感染细胞。
  4. 感染 30–60 分钟后，吸除接种液，用 PBS 洗涤两次，然后加入补充了适当浓度诱变剂的新鲜培养基。
  5. 在第 1 和第 2 节中确定的、对应于该条件下病毒滴度达到最大值所需的时间段内进行培养。收集子代病毒。
  6. 对每一代传代病毒进行滴度测定，并重复上述 3 个步骤。
  7. 在前几次传代过程中，经诱变剂处理的样品其病毒滴度应较原始病毒滴度和对照组（未经处理且未经传代）病毒滴度有所下降。若经诱变剂传代处理的样品其病毒滴度回升至与未经处理的对照组相同水平，则表明该病毒群体可能含有对诱变剂具有抗性的变异株。可能需要进行多达 20 或 30 次传代，尽管我们大多数保真度变异株是在 5 到 15 次传代之间分离得到的。
  8. 当某一传代系列的病毒滴度达到与未经处理对照组相同的数量级时，从包括同期未经处理对照组在内的所有样品中提取 RNA。可使用商品化 RNA 提取试剂盒或 Trizol 法进行提取。
  9. 使用可扩增目标病毒聚合酶或复制酶基因的引物进行 RT-PCR。第二步应对全基因组（至少包括编码区）进行测序，以检查抗性表型是否也定位于病毒的其他基因。这一点对于核苷类似物类诱变剂（如利巴韦林）尤为重要，因其还会影响病毒和细胞功能的其他方面。在此情况下，该变异株可能抵抗的是这些其他抗病毒活性之一，而非保真度变异株。
  10. 使用 PCR 纯化试剂盒纯化 RT-PCR 产物，并进行测序，以获得诱变剂抗性群体的共识序列。应包括测序误差的背景对照（见讨论部分）。
  11. 使用序列比对软件，并以病毒共识序列为参考序列进行比对分析。重点识别新出现的点突变，特别是那些仅在诱变剂处理组、且在病毒滴度恢复至正常水平时的传代样本中出现的突变。若该突变在早期传代中不存在，且在同期未经处理的对照组中也未出现（排除细胞培养适应性变异的可能），则该突变很可能至少部分地介导了诱变剂抗性。不应仅依赖碱基调用序列（即序列文本）和比对软件的结果，还应检查色谱图中可能被比对软件遗漏的次要峰信号。占总群体 20–30% 的突变体仍会表现为可识别的峰，但其峰高可能不足以被标准序列分析软件识别为“N”峰。

4. 一旦鉴定出突变，分离或构建该突变体，并验证其对多种RNA诱变剂的抗性表型

接下来，分离携带已鉴定突变的病毒株，以确认其与耐药表型的关联。必须在遗传背景纯净（即基因组其他区域无额外突变）的条件下研究疑似影响复制保真度的突变。在理想情况下，存在一个感染性cDNA克隆，可通过在纯净遗传背景上进行定点突变，从而获得耐药突变株的病毒储备。此时，无需进行第4节所述步骤。然而，若缺乏cDNA克隆，则可通过下述的噬斑纯化法分离病毒株。可能需要进行多轮噬斑纯化，才能获得遗传背景纯净的突变株。

  1. 通过噬斑实验分离诱变剂抗性突变体。
    1. 为分离已鉴定的突变体，在6孔板中使用琼脂糖（终浓度0.5至1% wt/vol）覆盖层进行标准的噬斑实验。根据病毒储备液的滴度，制备病毒的系列稀释液，使其稀释度能够产生10至50个彼此分离良好的噬斑。
    2. 当噬斑清晰可见时（通常在感染后2至5天，具体取决于病毒种类），在培养板上标记噬斑的位置，并使用带滤芯吸头的p200移液枪，将吸头轻轻插入琼脂糖覆盖层中，注意不要扰动或移动覆盖层的位置（否则会导致不同噬斑之间的交叉污染）。
    3. 小心地将吸头从覆盖层中取出，并将吸头内含有的琼脂糖小柱转移至含有250 μl培养基的离心管中，随后进行涡旋振荡。即使取出的吸头中未携带琼脂糖也无需担心，因为对于许多RNA病毒而言，单个平均大小的噬斑含有约105个病毒颗粒，仅通过将吸头接触噬斑表面即可转移足够量的病毒。
    4. 每种诱变处理条件下选取最多10个噬斑。根据鉴定突变所用的测序色谱图，估算群体中携带目标突变的大致比例。目标是分离出三个或四个携带该突变的噬斑。其中一些突变体可能还携带额外的非预期突变，这些将在后续通过测序加以识别。
    5. 从这些样本中提取RNA（但保留一半样本用于制备更大批次的病毒储备液），并进行RT-PCR扩增，以实现全基因组测序。通常情况下，RNA病毒相对于共识序列平均可携带多达两个突变位点；因此，建议每次对3至4个经噬斑纯化的病毒进行测序，以鉴定出仅含有目标突变而无其他额外突变的病毒株。
    6. 一旦鉴定成功，利用上述获得的噬斑纯化样本感染更大规模的细胞培养物（例如T75培养瓶中的8×106个HeLa细胞），制备该病毒的大量储备液，用于后续所有实验研究。
  2. 验证已鉴定突变所赋予的诱变剂敏感性/抗性表型。
    1. 利用已分离或新构建的克隆，以及在相似条件下制备的野生型对照病毒，重复第2节中的实验，可采用一系列完整的诱变剂浓度梯度，或使用最初产生抗性突变的特定浓度。
    2. 使用多种不同的RNA诱变条件（利巴韦林、5-氟尿嘧啶、5-氮杂胞苷、提高Mg2+或Mn2+浓度）。如果该聚合酶变异体对多种诱变剂均表现出抗性，则其更可能属于高保真型变异体。然而，也存在某些抗性突变仅特异性针对单一诱变条件的情况，尤其是考虑到上述部分化合物可通过多种机制影响RNA病毒8。

5. 检查复制速率

由于影响保真度的突变通常位于聚合酶上，相同的聚合酶突变可能会显著改变复制动力学。因此，确定复制过程中的相似性与差异性至关重要，这将有助于更准确地比较下文所述的突变频率差异。为此，应采用至少两种互补的方法来检测复制：一种用于检测病毒产生，另一种用于检测RNA合成。

  1. 一步法病毒生长动力学
    1. 实验前一天，根据需要接种6孔板，每个检测时间点使用一块板。建议每种突变株和野生型病毒均设置三个重复孔。
    2. 实验当天，吸除培养基，以每个病毒MOI为10的剂量接种各孔，以确保所有细胞同时被感染。在37°C下孵育30–60分钟。
    3. 每隔10分钟轻轻摇动培养板，防止细胞单层干燥。吸除病毒液，用2 ml PBS洗涤两次。应尽可能彻底清除接种物。随后加入新鲜培养基。
    4. 在感染后时间=0时，收集其中一块板的病毒。将剩余培养板放回培养箱，并在覆盖一个完整复制周期的时间点定期收集病毒（例如3 h、5 h、7 h、9 h、12 h、24 h）。
    5. 对每个时间点收集的病毒进行滴度测定（如空斑试验、TCID50、FFU试验），并绘制滴度随时间变化的生长曲线。
  2. RNA合成动力学
    可通过以下任一方法监测RNA合成动力学。若条件允许，应使用与测定一步法生长动力学相同的样本进行RNA水平检测。
    1. qRT-PCR。该方法可在较宽范围内提供高度定量的复制水平数据，从几个基因组拷贝到>1010，具体取决于检测的灵敏度。设计引物和探针时应覆盖基因组中一段高度保守的小片段区域（<200 bp）。
    2. Northern印迹分析。尽管定量性不如qRT-PCR，但该技术可直观验证复制是否产生全长基因组，并确认聚合酶突变未导致明显的链终止现象。
    3. 报告基因表达检测。若可获得表达报告基因（如荧光素酶）的cDNA克隆，则可用其作为替代指标来评估复制能力。然而，该重组病毒不应用于其他应用（如突变频率测定），因为作用于该病毒的选择压力与其他病毒不同，尤其是此类病毒倾向于删除插入的报告基因。

6. 测定突变频率

这是确认所鉴定的聚合酶突变是否通过改变复制保真度而赋予病毒对诱变剂产生抗性的关键步骤。需要注意的是，此处测量的突变频率并非突变率。要确定突变率，必须精确测定复制动力学参数（如合成的RNA量和复制周期长度）。然而，只要监控了传代历史和复制动力学，测量突变频率即可提供可重复且定量的复制保真度评估。突变频率既可在具有感染活性的病毒群体中（如蚀斑克隆或有限稀释法）测定，也可在总病毒群体中（如病毒原液或上清液）测定。为测定突变频率，应从较晚代次的病毒传代中制备病毒原液（例如第2代或更晚代次）。重要的是，病毒群体应有足够时间扩展其遗传多样性，使其更接近突变-选择平衡状态。

  1. 具有感染能力的病毒群体的突变频率
    该方法虽然更为繁琐，但可提供有关保持复制能力的平均基因组所携带突变数量的信息。然而需要注意的是，该方法会偏向于筛选出适合度较高的变异株，而适合度较低但仍有感染能力、难以形成噬斑的变异株可能无法被检测到。因此，该方法也可用于更准确地评估同义（dS）和非同义（dN）核苷酸替换率，从而探讨群体中是否存在正向选择作用。但由于检测到的突变数量较少，进行统计分析时需要更多的测序样本。该技术依赖于通过噬斑纯化或有限稀释法分离单个病毒（如上所述）。作为起始建议，我们推荐分离48个野生型病毒及其耐突变剂变异株的独立“克隆”。通过该方式分离的每个克隆群体预期携带其原始基因组所具有的突变。从分离的噬斑或有限稀释孔中提取的RNA量通常足以用于RT-PCR扩增。如有必要，可在最少数量的细胞上（例如24孔板格式）进行短时间扩增（少于一个复制周期）以获得更多RNA；但应尽量减少扩增次数，以避免新突变的积累。注意，每个待比较的克隆及群体必须经历相同数量的复制周期。
    1. 通过噬斑纯化或有限稀释法分离24至48个病毒克隆。
    2. 从分离的克隆群体中提取RNA。
    3. 对每个样本进行RT-PCR扩增，片段长度可达3 kb。最好覆盖结构蛋白区域，该区域相较于非结构基因中更保守的区域通常能耐受更多可存活的突变。
    4. 纯化PCR产物，进行测序并执行突变分析（第7节）。
  2. 总病毒群体的突变频率
    尽管该方法的第二个优势在于测序过程中可包含适合度较低的变异株，从而更全面地反映突变谱。然而，由于致死性改变（如RNA结构改变、终止密码子、显著的氨基酸变化）无法完全识别并仍会被保留在分析中，因此该方法可能不适用于假设病毒群体具有感染能力的系统发育分析（例如dN/dS值）以及关键突变的鉴定。尽管如此，当缺乏体外生化检测手段时，该技术仍可使研究人员获得最具统计显著性的数据，以确认复制保真度的改变。该方法依赖于对总病毒颗粒RNA进行RT-PCR扩增，包括那些带有低适合度或致死性突变、无法形成噬斑的基因组。通过该方法获得的突变频率可能比通过噬斑或有限稀释克隆法高出10倍。
    1. 从总病毒颗粒群体中提取RNA。
    2. 对基因组编码区中已知可耐受突变且具有遗传多样性的区域（例如结构蛋白区域）进行800至1200个核苷酸的RT-PCR扩增。较大的片段难以有效插入TopoTA等克隆载体，导致转化子数量不足。虽然更小的片段效果更佳，但测序覆盖范围可能过小，难以达到统计显著性。至少800 bp的片段可通过两个引物实现序列覆盖，是最大化测序覆盖范围与最小化测序成本之间的良好折中方案。我们发现，对800个核苷酸区域进行70至100次测序，可稳定地验证我们在实验室中研究的变异株保真度的改变。请注意，其他载体/克隆方法也可达到同等效率。
    3. 使用商业试剂盒或标准DNA提取/沉淀方法纯化RT-PCR产物。
    4. 如果所使用的RT-PCR酶不能产生A突出末端，则通过添加1 μM ATP和Taq DNA聚合酶进行10分钟的延伸反应。
    5. 按照制造商说明进行TopoTA克隆。
    6. 对每个待研究的病毒群体，选择96个在XGal包被平板上通过蓝/白筛选鉴定为阳性插入的克隆。初始阶段应对每种不同基因区域的克隆检测插入片段的存在，以通过琼脂糖凝胶质粒大小筛选或单克隆PCR验证蓝/白筛选的有效性。使用上述片段大小和条件，我们可获得约90%的阳性率。
    7. 在96孔细菌培养板中，将每个克隆于1 ml LB培养基中液体培养基中过夜培养。
    8. 次日以96孔板格式制备质粒小提（miniprep）。
    9. 使用足够数量的引物（例如用于RT-PCR的引物，或TopoTA m13引物）对每块板进行测序，以最大程度覆盖克隆片段。进行突变分析（第7节）。

7. 序列分析

使用每个群体的参考序列或共识序列及适当的比对软件进行序列分析。我们推荐使用 Lasergene 或 Sequencher，这些软件可便捷地识别相对于共识序列的单核苷酸多态性（SNPs）。

  1. 使用适当的软件（例如 Lasergene 或 Sequencher）对序列进行比对。
  2. 剔除质量较差的序列（碱基识别错误、含有过多的“N”或长度过短）。确定所有序列共同覆盖的核苷酸范围。由于基因组不同区域对突变的耐受程度不同，为了便于比较，必须确保每个保留用于分析的测序克隆在相同区域均有完整覆盖。因此，若每个克隆进行了多次测序反应，而其中某一序列在特定克隆中失败，则应将该克隆的所有序列从分析中剔除。
  3. 识别并统计与参考株不同的单核苷酸多态性（SNP）。
  4. 通过将识别出的SNP总数除以测序的总核苷酸数（克隆数 × 测序区域长度），计算突变频率。将该数值表示为每10,000个核苷酸中的平均突变数，比以单个核苷酸为单位更便于理解。例如，表1中野生型群体的计算为：55个突变 / 121,978个总核苷酸 × 10,000 = 每10,000个测序核苷酸中4.51个突变。
  5. 如果同一SNP出现在大量克隆中，应提供两个数值，分别包含和排除这些重复突变。通常情况下，对于由均质亲本（通过空斑纯化或感染性克隆获得）并在细胞培养中仅传代数次的病毒群体，正向选择尚未充分发挥作用导致同一SNP的累积，因此以这种方式测得的突变频率更能真实反映聚合酶的错误频率，而受正向选择或纯化选择的影响最小。
  6. 确定突变分布情况。列出每个群体中携带0、1、2、3……个突变的克隆数量，并按顺序排列。
  7. 通过成对距离比较计算病毒群体多样性。将经过清理和人工编辑的序列与参考区域一起构建比对序列。目前有多种比对程序可供使用：ClustalW/X（http://www.clustal.org/）、MUSCLE（http://www.drive5.com/muscle/）、适用于Mac用户的EbioX（http://www.ebioinformatics.org/ebiox/）等。确保所有序列长度一致，必要时进行裁剪。建议序列起始位置为编码密码子，以便后续分析。建议将所有比对结果保存为fasta格式，该格式可被大多数软件直接读取。
  8. 进行成对距离分析时，计算同一群体内所有可能的序列两两之间的比较结果。通过计算这些比较中发现的平均突变数，可反映群体的异质性。
  9. 群体内的同义突变率（dS）和非同义突变率（dN）可轻松获得。我们发现MEGA软件（http://www.megasoftware.net/）在进行此类分析时功能强大且易于操作。
  10. 为判断选择方向，提供以下两种方法（但不限于这两种）：1）计算dN与dS的比值。比值大于1表示存在正向选择；比值小于1表示存在纯化选择。2）使用Datamonkey网络服务器（http://www.datamonkey.org/），以fasta格式上传比对序列，并使用SLAC模块进行分析，该模块将提供dN/dS的估计值。
  11. 进行统计学分析。根据数据量和序列数量的不同，可采用多种检验方法。一些研究采用卡方检验，将所有克隆合并后比较突变总数与共识核苷酸总数9；另一些研究则采用Fisher精确检验，基于携带突变的序列数与无突变序列数进行计算10。若生成了足够的突变数据，我们建议使用秩和检验（如Mann-Whitney U检验）。具体操作为：根据每条测序RNA上的突变数量，对各病毒群体中的克隆进行排序，Mann-Whitney U检验将用于检测群体间突变分布的差异。因此，我们建议至少测序800个碱基对，以提高发现携带多个突变克隆的可能性。该检验方法稳健，但需要较大的样本量。另一方面，它不要求被比较的两个群体具有相同的样本量（例如，表1中的样本量分别为n1=148 和 n2=84）。

8. 代表性结果：

突变剂浓度对细胞活力和病毒活力的剂量依赖性效应如图1所示。在本示例中，我们发现，在100 μM AZC条件下传代病毒，其病毒滴度降低了目标值10.5-2 log，但在病毒感染所需的2天内，HeLa细胞活力未受到负面影响。该预实验结果促使我们选择100 μM AZC浓度用于病毒的连续传代，以筛选获得对突变剂具有抗性的病毒株。图2展示了病毒滴度的初始下降，随后出现突变剂抗性表型。在突变剂中进行最初几次传代时，随着致死性突变的积累，病毒滴度显著下降。随后，逐渐出现一种对突变剂具有抗性的变异株，其出现伴随着病毒滴度恢复至与未处理对照组无显著差异的水平。在此阶段，病毒群体中有很大比例携带抗性突变。对该病毒群体进行测序可鉴定出导致抗性的氨基酸改变。一旦被鉴定、分离或重新构建，该突变剂抗性病毒可能相较于野生型对不同RNA突变剂（例如结构不同的碱基类似物）的敏感性降低。图3显示了一株对RNA突变剂具有抗性的柯萨奇病毒B3，在利巴韦林、5-氟尿嘧啶、5-氮杂胞苷以及高浓度MgCl2和MnCl2存在下，其滴度高于野生型。对多种RNA突变剂的广泛抗性是复制保真度提高的有力证据。验证保真度变异株的复制动力学与野生型病毒相似，将有助于比较突变频率。图4展示了高保真度变异株与野生型病毒的单步生长动力学。若复制速率和最终滴度不相似，则应采取措施比较经历相同复制轮次且规模相当的病毒群体。RNA合成速率与复制保真度之间的关系尚不明确，尤其是在体内条件下。较慢的复制速率可能导致突变频率降低（即保真度更高），但如图4所示，这并非绝对规律。在确定上述参数后，可通过比较保真度变异株与野生型群体的突变频率，获得复制保真度改变的遗传学证据。图5展示了野生型与高保真度变异株的序列比对结果，并标出所鉴定的点突变。统计突变数量，并按每个克隆的突变数进行排序（表1），以每10,000个测序核苷酸中每个群体的平均突变频率表示，如图6所示。

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图1. 筛选RNA突变抗性最优条件的确定：在保持高细胞存活率的同时实现适度的病毒滴度下降（1-2个对数级）。 HeLa细胞用指定浓度的利巴韦林处理，并以0.01的感染复数（MOI）感染野生型柯萨奇病毒B3。感染后48小时，收集子代病毒，并通过TCID50法测定病毒滴度。在x轴下方所示的是48小时时经台盼蓝染色测定的存活细胞百分比。结果显示，100和200 μM浓度可使病毒滴度降低1-2个对数级，同时不影响细胞活力。

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图 2. 在中等浓度RNA诱变剂存在下连续传代可筛选出对诱变剂具有抗性的病毒群体。 本图中，基孔肯雅病毒在含有50 μM 利巴韦林的HeLa细胞中进行连续传代（灰色柱）。对照组传代在无利巴韦林条件下进行（黑色柱）。每次传代后，通过BHK细胞上的经典蚀斑实验定量子代病毒。在前几次传代中（p1和p2，相对于起始群体p0），诱变效应明显，经处理病毒的滴度下降2个数量级。随后，滴度逐渐恢复至正常（未经处理）水平。在第5次传代中，经诱变剂处理的病毒群体与未经处理的群体相比未见显著差异，表明已筛选出具有抗性的变异株。事实上，对病毒群体进行的一致性测序鉴定出在利巴韦林处理过程中出现的独特突变。

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图3. 对不同结构RNA致突变剂广谱抗性的验证。 此处显示的是，在第3节所述筛选中最初分离到的柯萨奇病毒B3高保真A372V变异株，由感染性克隆产生，并检测其对不同浓度的多种RNA致突变剂（利巴韦林、5-氟尿嘧啶、5-氮杂胞苷）的相对敏感性。HeLa细胞用指定浓度的利巴韦林处理后，以0.01的感染复数（MOI）感染野生型柯萨奇病毒B3。感染后48小时，收集子代病毒，并通过TCID50测定滴度。图中显示了野生型（实线）和A372V变异株（虚线）滴度随致突变剂浓度变化的情况。在所有测试条件下，A372V的滴度均持续高于野生型。

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图 4. 病毒复制速率与保真度变异体。 为确定病毒产生的单步生长动力学，使用 MOI = 10 的野生型（实线）、高保真度变异体 A372V（长虚线）或复制缺陷型变异体 Cx64（短虚线）的柯萨奇病毒 B3 感染 HeLa 细胞。在指定时间点，通过冻融法收集细胞及上清中的子代病毒，并采用 TCID50 法测定滴度。A372V 的保真度提高并未伴随在组织培养中可观察到的复制缺陷。变异体 Cx64 在复制动力学上表现出显著延迟，其达到的最高滴度比野生型病毒低 1000 倍。

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图5. 各病毒群体中TopoTA克隆序列的比对。 根据第7节所述方法，从克隆的RT-PCR产物中获得的每条序列可能来源于病毒群体中某个单一且独特的基因组，因此会携带独特的突变。该图显示了在去除低质量序列并可视化单核苷酸多态性（SNP）后得到的典型比对结果。统计群体中总的SNP数量（本图中为10个），并记录每条克隆所含的SNP数目。例如，由横线标出的克隆含有2个独特突变，而其余8个克隆各含有1个独特突变。该数据用于生成表1。如需查看此图的更大版本，请点击此处。

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图6. 病毒群体突变频率的图示。 为了便于解读，可将序列分析和统计分析获得的数值数据以图表或直方图（如图所示）的形式呈现。A372V 病毒产生的突变少于野生型，其突变频率显著降低（*，p<0.01）。Cx64 变异株的复制滴度比野生型低 1000 倍，但其突变频率与野生型相同（ns，无显著性差异），表明复制速度与保真度之间并不必然相关。无论使用病毒原液还是稀释 105 倍的样品进行 RNA 提取，同一基孔肯雅病毒（CHIKV）群体均表现出相似的突变频率。

统计分析的突变分布汇总。

注意：对于每个克隆，必须覆盖相同的基因组区域（以及序列长度）。在本例中，每个克隆为859个核苷酸。这对于统计分析至关重要。另一方面，用于统计分析的秩和检验并不要求样本量必须相同，研究者可自由比较不同样本量的群体。因此，野生型的142个克隆可与A372V突变型的84个克隆进行比较。

含 n 个突变的克隆数野生型A372V
7 个突变00
6 个突变00
5 个突变00
4 个突变00
3 个突变10
2 个突变62
1 个突变4014
0 个突变9568
总突变数5518
测序的总克隆数14284
测序的总核苷酸数121,97872,156
每 104 个核苷酸的突变数4.512.49

表1. 用于统计分析的突变分布汇总。 注意：对于每个克隆，必须覆盖相同的基因组区域（以及序列长度）。在本例中，每个克隆覆盖859个核苷酸。这对于统计分析至关重要。另一方面，用于统计分析的秩和检验并不要求样本量相同，研究者可自由比较不同样本量的群体。因此，野生型的142个克隆可以与A372V突变型的84个克隆进行比较。

讨论

细胞系的选择。 碱基类似物作为RNA诱变剂的效果与其在不同细胞类型中的相对摄取量相关11。如果通常用于病毒传代的细胞系对诱变剂的摄取具有抗性或过于敏感（细胞毒性过高），则可能需要选用另一种能够满足这些要求且仍允许病毒复制的细胞系。一旦分离得到诱变剂抗性变异株，后续的表征工作可在原先首选的细胞系中进行。根据我们的经验，HeLa细胞能高效摄取诱变剂；BHK细胞需要高达10倍的浓度；而Vero细胞则对诱变剂的摄取具有抗性。

诱变剂的选择。 在尝试通过诱变处理分离保真度变异株时，若使用多种不同类型的诱变剂，成功概率会更高。结构不同的碱基类似物诱变剂在复制过程中会被错误地掺入基因组，并在后续复制周期中主要导致特定类型的突变：利巴韦林处理倾向于诱导G→A和C→U的转换突变12；5-氮杂胞苷具有类似的偏向性，此外还可引起C→G和G→C的颠换突变13；5-氟尿嘧啶则优先诱导A→G和U→C的转换突变14。另一种方法是在培养基中添加较高浓度的Mg2+或Mn2+，以提高RNA病毒的整体突变频率，且不具有上述偏向性12。根据病毒的密码子序列以及生成保真度变异株所需的密码子改变，某些条件将比其他条件更有利于该类变异株的出现。对于具有更高保真度的脊髓灰质炎病毒G64S和柯萨奇病毒A372V，利巴韦林处理最易筛选出这些变异株，因为其密码子位点所需的A→G转换突变恰好与利巴韦林主要诱导的突变类型一致。

感染复数与群体大小。 在病毒学中，组织培养感染的实验方案特别关注感染复数（MOI），例如，为避免缺陷型干扰颗粒的积累（低MOI）或促进病毒间的重组（高MOI）。为了在连续传代过程中筛选出新出现的突变事件，还必须考虑病毒群体的大小。由于耐药突变体最初频率较低，最好在每次传代时尽可能转移较大的病毒群体（例如105-106个病毒），以避免在每一轮传代中丢失这些新出现的变异株。如果担心MOI升高，可通过增大培养孔或培养瓶的规模（即增加被感染细胞的数量）来尽量减少MOI的上升。另一方面，在测试病毒对诱变剂敏感性的实验中，通常采用低MOI感染，以增加实验过程中发生的复制周期次数，并防止在共感染细胞中，高适应性基因组通过互补作用“拯救”被诱变的基因组。这一点非常重要，因为在第一轮复制过程中子代基因组上产生的突变并不会立即被检测到。大多数被诱变的RNA仍会被包装进病毒粒子中。只有在下一轮感染时，这些基因组中存在的致死突变才会导致复制周期中止，并引起病毒滴度下降。通常需要经过多轮突变积累后，才能观察到致死性诱变的显著效应。最后，如果在诱变剂存在下连续传代过程中，病毒滴度持续下降直至灭绝，研究人员应尝试在逐渐增加的诱变剂浓度下进行传代（从极低浓度开始）。

从RNA诱变剂抗性群体中分离并获得RNA诱变剂抗性克隆。 RNA诱变剂会在每个基因组中引入多个随机突变，但通过抗性筛选仅能富集（并固定到共识序列中）那些赋予抗性的突变。为了鉴定该突变，我们对诱变剂抗性群体进行测序（即群体的共识序列），而非对单个病毒进行测序。因此，由诱变剂产生的单个随机突变在测序结果中不会被检测到；只有在筛选后导致共识序列发生变化的突变才会被发现。根据我们的经验，通常仅能识别出一到两个此类共识序列变化。一旦获得诱变剂抗性群体并确定了抗性突变，就有必要制备该变异株更纯的毒种。上文已描述了空斑纯化方法。或者，如果目标病毒不能形成易于识别的空斑，则可通过有限稀释法纯化所需变异株。该方法本质上是以96孔板格式进行的TCID50实验，即将病毒原液稀释至感染率低于50%的浓度。采用此稀释度后，参照上述方法，可分离最多10个独立的变异株，并确认其序列。如前所述，在理想情况下，目标病毒株的感染性cDNA克隆是可获得的，此时便无需进行病毒分离。根据我们的经验，复制保真性变异株通常由单个氨基酸替换引起，因此可使用商业化定点突变试剂盒（如Quikchange，Agilent）直接构建。另一种选择是使用亲缘关系较近病毒株的cDNA克隆。然而，若使用近缘病毒株，我们强烈建议同时采用该方法和病毒分离法（例如空斑纯化），因为我们发现同一保真性相关突变在两种近缘病毒中未必产生相同的功能效应。

保真性与复制。 筛选对RNA诱变具有抗性的变异株已成功分离出保真性更高和更低的变异株，其生长特性与野生型对应株相似4,12,15。目前，聚合酶活性速率与保真性之间的关联尚未完全阐明。利用纯化的RNA聚合酶进行的体外生化研究表明，高保真性变异株的加工速率较慢，而低保真性变异株通常具有更快的加工速率1-3,12。在组织培养中，这些差异通常并不明显，提示资源的可利用性而非聚合酶固有的动力学特性是限速步骤。如果保真性变异株的复制动力学与野生型无显著差异，则可直接比较它们的突变频率。若复制动力学存在极为显著的差异，则应对数据进行归一化处理以校正动力学差异，例如通过比较经历相同复制周期数的病毒。根据我们的经验，尽管野生型与高保真性变异株之间在单步生长动力学上未观察到显著差异，但我们发现高保真性变异株的滴度 consistently 更高（在1个数量级内），而其产生的RNA量略少（处于同一数量级），这进一步表明它们产生的基因组含有较少突变，因而具有更强的感染性。

样品制备与测序。 在这些实验方案的所有步骤中，必须使用高保真、具有校读功能的酶进行 PCR 和 RT-PCR，以尽量减少引入额外突变，因为这些人为突变无法与生物学上有意义的突变相区分。待比较的病毒群体必须在相同条件下制备（传代历史、组织培养基、温度、RNA 提取方法、RT-PCR 方案等）。此外，必须确保 RNA 提取获得了足够的起始材料，以便 RT-PCR 能产生清晰的条带。RNA 样品进行 1/100 稀释后也应能检测到 RT-PCR 条带，这表明样品中含有足够数量的 RNA 分子，可避免代表性偏差（即反复扩增同一基因组）。由于突变频率呈分布状态，只要不存在上述偏差，无论群体规模如何，都应获得相似的数值。如图 6 所示，病毒储备液进行 105 倍稀释后所得的突变频率与亲本储备液相比无显著差异。

在确定TopoTA克隆的最佳条件之前，应在蓝白斑筛选后通过菌落PCR确认插入片段的存在，然后再进行测序。为了控制突变噪声（由RT-PCR和测序引入的突变），可克隆含有相同病毒序列的质粒的PCR产物，和/或克隆并测序对应于病毒基因组的体外转录RNA的RT-PCR产物作为对照（需注意不同的体外转录酶具有不同的错误率，可能无法真实反映实验流程中的本底错误水平）。某些病毒序列可能对细菌具有毒性，因此在决定用于突变频率分析的病毒基因组区域之前，必须验证其对细菌的影响。在分析TopoTA获得的序列时，应注意每个克隆应仅包含一个插入片段/序列。若出现双峰信号，提示可能存在混合群体，其原因可能是挑选了两个相邻的细菌菌落。尽管细菌复制过程中的突变频率极低，但也不能完全排除突变是在细菌培养中质粒扩增过程中引入的可能性。在噬斑纯化的群体中，双峰可能源于重叠的噬斑，或病毒在噬斑形成过程中正在获得新突变或发生突变回逆。在分析时应保持一致性，并事先决定是否将此类突变纳入统计。

最后，请注意此处使用的突变频率为相对值。这些数值仅在比较相同条件下培养并在相同区域测序的病毒群体时有效！不应将其视为突变率的绝对值，或整个基因组的突变频率。然而，在实验条件受控的情况下，这些数值确实能够实现对突变分布和频率差异的可重复、定量比较。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作获得了巴黎市医学与卫生研究基金、法国国家研究局基金（ANR-09-JCJC-0118-1）以及欧洲研究委员会启动基金RNAvirusPopDivNVax项目（编号242719）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
利巴韦林Sigma-AldrichR9644-10MG
5-氟尿嘧啶Sigma-AldrichF6627-1G
5-氮杂胞苷Sigma-AldrichA2385-100MG
MgCl2Sigma-AldrichM1028-100ML
MnCl2Sigma-AldrichM1787
台盼蓝Sigma-AldrichT8154-20ML
TopoTA 克隆试剂盒Invitrogen10351021
Quikchange 定点突变试剂盒Agilent Technologies200516若已有cDNA感染性克隆
96孔质粒小提试剂盒Macherey-Nagel740625
Lasergene、SequencherDNASTARwww.dnastar.com www.genecodes.com或其他序列比对软件

参考文献

  1. Arias, A. Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin. J Virol. 82, 12346-12355 (2008).
  2. Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. E. Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase. J Biol Chem. 280, 25706-25716 (2005).
  3. Korneeva, V. S., Cameron, C. E. Structure-function relationships of the viral RNA-dependent RNA polymerase: fidelity, replication speed, and initiation mechanism determined by a residue in the ribose-binding pocket. J Biol Chem. 282, 16135-16145 (2007).
  4. Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).
  5. Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice. PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).
  6. Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population. Nature. 439, 344-348 (2006).
  7. Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity. Nat Med. 14, 154-161 (2008).
  8. Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis. J Mol Med. 80, 86-95 (2002).
  9. Coffey, L. L., Vignuzzi, M. Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures. J Virol. 85, 1025-1035 (2011).
  10. Ciota, A. T. Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus. J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).
  11. Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. K. Reduced ribavirin antiviral efficacy via nucleoside transporter-mediated drug resistance. J Virol. 83, 4538-4547 (2009).
  12. Levi, L. I. Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds. PLoS Pathog. 6, e1001163-e1001163 (2010).
  13. Sierra, S., Dávila, M., Lowenstein, P. R., Domingo, E. Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity. J Virol. 74, 8316-8323 (2000).
  14. Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV). Virology. 308, 37-47 (2003).
  15. Sierra, M. Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe. J Virol. 81, 2012-2024 (2007).

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RNA RNA TCID50

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