对病毒载量低于检测下限（50-75 拷贝/ml）的个体，其血浆中 HIV-1 RNA 水平的定量以及单个 HIV-1 基因组的测序均较为困难。本文介绍如何利用一种实时 PCR 检测方法提取并定量血浆病毒 RNA，该方法可稳定检测低至 0.3 拷贝/ml 的 HIV-1 RNA，并介绍如何对病毒载量极低的样本进行单基因组扩增测序。
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摘要
摘要
对于自然控制感染或接受联合抗逆转录病毒治疗（cART）的患者，扩增病毒基因并定量检测病毒载量低于标准检测方法检出限（低于每毫升50-75拷贝）的HIV-1感染者体内的HIV-1 RNA，对于深入了解病毒动力学及病毒与宿主之间的相互作用至关重要。
本文介绍了如何通过单基因组测序（SGS方案）13, 19扩增病毒基因组，以及如何准确量化病毒载量较低患者的HIV-1 RNA（单拷贝检测（SCA）方案）12, 20。
单拷贝检测是一种实时 PCR 检测，其灵敏度取决于所检测血浆的体积。若在 7 ml 血浆中检测到一个病毒基因组，则报告的 RNA 拷贝数为 0.3 拷贝/ml。该检测包含一个内参对照，用于评估 RNA 提取效率，并设有检测 DNA 扩增或污染可能性的对照。患者样本均进行三复孔测定。
单基因组测序检测（SGS）目前已被广泛使用，且被认为操作不繁琐3, 7, 12, 14, 15，它是一种有限稀释法，将终点稀释后的cDNA产物分配至96孔板中。根据泊松分布，当少于1/3的孔产生扩增产物时，该PCR产物来源于单个cDNA分子扩增的概率可达80%。与克隆方法相比，SGS的优势在于不会发生重复取样，且不受PCR过程中引入的重组偏差影响19。然而，SCA和SGS的扩增成功率依赖于引物设计。这两种检测方法最初均针对HIV-1 B亚型开发，但通过更换引物、探针和标准品，可适用于其他亚型及基因组其他区域。
方案
1. 从大量血浆中提取RNA
单拷贝检测（SCA）和单基因组测序（SGS）方案的概述见图1和图2。
- 为获得 7 ml 血浆，将采集于 15 ml EDTA（非肝素）采血管中的约 14 ml 血液在 2,600 xg 条件下离心 15 分钟（不启用刹车）。用移液器小心吸取血浆（避免吸取白膜层），转移至 15 ml 离心管中。
- 若 RNA 将用于单拷贝检测（SCA），需向血浆中加入 30,000 拷贝的劳斯肉瘤病毒内源性病毒对照（RCAS）。RCAS 病毒需在 SCA 检测前按先前所述方法制备（20）。简而言之，从细胞培养上清中收集 RCAS 病毒，通过逆转录酶活性进行定量，稀释至最终浓度为每 200 µl 含 30,000 个病毒颗粒，溶于含 5% FBS 的 RPMI 组织培养基中，并分装保存于 -80°C 单次使用 aliquot 中。RCAS 病毒在用于检测前不得经历冻融循环。将 RCAS 加入患者血浆中，以控制 RNA 提取效率及 PCR 定量的准确性。有关 RCAS 的更多信息，请访问以下链接：http://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/。
- 将血浆在 15 ml 圆锥形离心管中以 2,600 xg 离心 15 分钟（“预离心”），以去除可能干扰 RNA 准确定量的脂质和细胞碎片。
- 使用永久性记号笔在 Seton Easy-Seal 离心管上标记样本编号以及沉淀将在管中形成的位置。预离心后，用移液器将血浆转移至 Seton Easy-Seal 离心管中，避免转移表面的细胞碎片和/或脂质。记录加入的血浆体积。
- 加入 Tris 缓冲盐水（TBS）至 Seton-Easy-Seal 管中，使液体体积加至螺纹颈部底部。确保管内无气泡，否则在超速离心过程中会导致管体塌陷。将管放入转子时，确保标记朝外。
- 用可重复使用的盖子密封管子，将样品放入预冷的 Sorval T1270 转子中，并在 Sorval 90SE 超速离心机中于 4°C 以 170,000 xg（50,000 rpm）离心 30 分钟。
- 离心结束后，弃去上清液，在病毒沉淀（不可见）中加入 90 µl 分子级水和 10 µl 蛋白酶 K（20 mg/ml）。
- 将管子置于 55°C 水浴中孵育 30 分钟。确保管子倾斜放置，使含有沉淀的一侧浸入蛋白酶 K 与水的混合液中。
- 孵育后，在台式离心机中短暂离心（约 5 秒），使所有液体聚集于管底，然后加入 315 µl 6M 异硫氰酸胍溶液和 10 µl 20 mg/ml 糖原 （注意：请遵循此类危险物质的适当处置指南；切勿与次氯酸钠或酸类混合，应单独收集于专用容器中处置）。
- 轻轻涡旋混匀并短暂离心（约 5 秒）。室温孵育 10 分钟，然后将每管内容物转移至新标记的 1.5 ml 无 RNA 酶离心管中。
- 向每管中加入 495 µl 分子级异丙醇，涡旋 10 秒，室温下以 21,000 xg 离心 30 分钟。
- 弃去上清液，加入 500 µl 70% 乙醇。
- 涡旋 10 秒，室温下以 21,000 xg 离心 15 分钟。用移液器吸除乙醇，再次短暂离心，用移液器吸尽残留乙醇，室温下晾干 10 分钟。（对于 SGS 方案，将 RNA 溶解于 40 µl 5 mM Tris-HCl pH 8.0 中，并继续执行 SGS 方案）。
- 将沉淀溶解于 55 µl RNA 缓冲液中。RNA 缓冲液的配制方法为：将 10 µl 100 mM DTT 和 25 µl 40 U/µl Rnasin 加入 965 µl Tris-HCl（pH 8.0, 5 mM）中。置于冰上保存。
2. 单拷贝检测
一个96孔板可容纳8个患者样本，包括HIV和RCAS标准品及对照品。本方案将描述单个板的设置方法。
- 首先准备2份1 ml的RNA缓冲液，用于稀释HIV-1 RNA和RCAS RNA转录本，以制备RNA标准曲线。RNA缓冲液的配方见1.13。
- 在冰上使用2 ml离心管配制稀释液。通过加入25 μl的HIV-1 RNA标准品（1×10⁸ 拷贝/μl）至RNA缓冲液中，配制HIV-1 RNA转录本的半对数稀释系列。6 拷贝/微升）加入至54微升RNA缓冲液中，得到3×105 copies/μl
- 继续进行连续的半对数稀释（25 μl + 54 μl），直至达到每10 μl含0.3个拷贝（注意：0.3、1和3拷贝的稀释样本在分析中不纳入标准曲线，因其用于外推值，分析时应设为未知样本）。RCAS转录本原液浓度为1×106 拷贝/微升。同样地，在RNA缓冲液中制备RCAS转录本的半对数稀释液，稀释至每10微升含100拷贝。
- 按照表1中所列配方配制cDNA合成用的反转录（RT）预混液。根据表1中所列配方配制RT反应和无反转录酶对照（NRT）反应，注意需额外多配制少量以补偿转移过程中可能发生的损失。注意：在NRT预混液中，以水替代反转录酶，以控制DNA扩增的干扰。
注：此步骤最近已实现自动化，此外还可通过Qiagen机器人（原Corbett）进行板的设置。 - 设置光学96孔板（如图3所示），向每个孔中加入20 μl RT反应混合液。在标记为“NRT”的8个孔中，加入不含逆转录酶的混合液（NRT反应混合液）。将上述混合液加入孔板后，向标记为“无模板对照（NTC）”的孔中各加入10 μl水。向标记为“HIV”的孔中加入10 μl HIV转录本，浓度如图3所示。向标记为“RCAS”的孔中加入10 μl RCAS转录本，浓度对应如图3所示。向孔板示意图中标记为“Sample”的3个相邻孔中各加入10 μl患者样本。向标记为“NRT”的孔中加入10 μl洗脱样本。向标记为“内参对照（internal control）”的孔中加入5 μl相同样本和5 μl水。
- 密封培养板，并在热循环仪中运行以下程序： 25°C 15 分钟， 42°C 40分钟 85°C 10 分钟 25°C 30 分钟 5°C 保持。
- 根据表2配制PCR预混液。
- cDNA 合成完成后，转移至指定用于 cDNA 操作的区域。在此指定区域内，向 HIV 和 RCAS 的 cDNA 板各孔中分别加入 20 μl PCR 预混液。此步骤必须在指定区域进行，以避免可能的污染。
- 离心平板，使用ABI或Roche光学封膜密封，并覆盖光学毯（仅ABI 7700需要使用光学毯）。在Roche 480或ABI 7700仪器上运行。PCR条件： 95°C 10 分钟，然后进行 45 个循环 95°C 15 秒 60°C 1 分钟。RCAS 和 HIV 需分别进行分析。结果示例如图 4 所示。标准曲线的斜率会受到低拷贝数转录本正常泊松分布的影响。为了确保标准曲线获得最准确的斜率，将这些低拷贝数标准品（0.3、1 和 3 拷贝）设为“未知样本”。17
3. 单基因组测序
- cDNA 合成。在 96 孔 PCR 板（Biorad）的一个孔中加入 5 µL 10 mM dNTPs 和 5 µL 2 mM 基因特异性引物（pol 或 env）。加入 40 µL 提取的 RNA。密封 PCR 板。
- 在 PCR 仪中于 65°C 下变性 RNA-引物混合物 10 分钟。
- 配制 cDNA 合成所需的试剂（见表 3 所列）。变性步骤完成后，将 PCR 板置于冰上，向每个样本中加入 50 µL cDNA 合成混合液。
- 在 PCR 仪上运行 PCR 板：45°C 反应 50 分钟，85°C 延伸 10 分钟，然后 4°C 保存。
- 第一轮 PCR，10 µL 反应体系。在试剂槽中使用 p6-rt 或 env 的第一轮扩增引物配制 PCR 反应混合液（试剂见表 3，引物见表 5）。
- 使用多通道移液器将 8.0 µL PCR 混合液分配至 96 孔 PCR 板中的 73 个孔（70 个样本和 3 个阴性对照）。
- cDNA 合成完成后，将 cDNA 样品和含有 PCR 反应混合液的 PCR 板转移至专门用于 cDNA 操作的区域。在指定区域内，向每个 cDNA 样品中加入 40 µL Tris-HCl（pH 8.0），使最终体积达到 140 µL。向 70 个样本孔中各加入 2.0 µL cDNA，向每个阴性对照孔中加入 2.0 µL 水。密封 PCR 板。在 PCR 仪上运行反应，程序见表 4。
- 巢式 PCR — 20 µL 反应体系。在试剂槽中配制巢式 PCR 所需的试剂（试剂见表 3，引物见表 5）。
- 使用多通道移液器将 18 µL 巢式 PCR 混合液加入新的 96 孔 PCR 板中的 73 个孔。
- 将第一轮 PCR 产物按 1:5 稀释，向每个巢式 PCR 孔中加入 2 µL 第一轮 PCR 产物。在 PCR 仪上运行 PCR 反应，条件见表 4。
- 在 1% 琼脂糖凝胶上电泳检测样本。为确保大多数 PCR 产物来源于单个 cDNA 分子，阳性孔的比例不应超过 30%。该过程已通过 Beckman Coulter Biomek FM 机器人实现自动化，用于将 PCR 板中的反应产物加载至 1%、96 孔 E-gel（Invitrogen）。E-gel 在 E-base 上运行 7 分钟。使用表 5 所列引物对扩增产物进行测序。
4. 代表性结果：
脊髓小脑性共济失调（SCA）：
所有对照均需合格，方可认为HIV-1 RNA测定结果准确。若阴性对照呈阳性，应弃用该次检测结果，因可能存在污染。为监控提取步骤中RNA的损失情况，血浆中添加的RCAS至少应回收50%。若平均RCAS回收率低于此值，则需重新评估提取过程的有效性。 <15,000 拷贝，则该样本不合格，应予以舍弃，因为在提取或方案的其他步骤中可能已丢失大量 RNA。这种情况在约 10% 的患者样本中出现，可能与血浆中高脂含量有关6RCAS病毒的回收旨在作为提取质量以及cDNA合成和PCR扩增效率的对照。该回收率不用于校正HIV的回收，因为HIV很可能与免疫球蛋白及其他人源蛋白结合，其性质与从组织培养中分离的病毒略有不同。在本实验室中，RCAS的回收量平均为25,716 ± 4,057 拷贝/反应体系，约为所添加RCAS RNA的95% ± 15%。17同时平行运行无逆转录酶（NRT）对照，以检测是否存在来自DNA的扩增。将NRT值从三个HIV-1 RNA值中分别减去后，计算平均值；若该数值小于零（即DNA扩增信号高于RNA扩增信号），则结果判为无效，应予以舍弃，因其存在由DNA而非RNA扩增导致结果偏差的风险。若仅在3个反应孔中的1个孔检测到HIV-1 RNA扩增，建议对样本重新检测，以确认扩增信号确实来源于待测样本本身，而非可能存在的污染物。
如果所有对照均通过，则可计算血浆中HIV-1 RNA的平均拷贝数。
示例1： 如果平均HIV-1拷贝数为零，则检测下限需根据检测所用血浆体积进行计算。举例说明：假设检测了7 ml血浆。本检测中可能检测到的最小RNA量为：在一个孔中为1个拷贝，另外两个孔中为0拷贝，即每孔平均0.33拷贝。然后将平均拷贝数乘以5.5的校正因子，以换算为RNA洗脱液中的总拷贝数（每孔含10 µl，但总洗脱体积为55 µl）。因此，检测下限为：5.5 × 0.33拷贝除以7 ml = 1.83/7 = 0.3拷贝/ml。本例中血浆中HIV-1 RNA的浓度为<0.3拷贝/ml。
示例 2：HIV-1 RNA 可被检测到。从 7 ml 血浆中提取 RNA。每孔中 HIV-1 RNA 的平均拷贝数计算为每孔 2.0 拷贝。则每毫升血浆中 HIV-1 RNA 的平均拷贝数为 5.5 × 2.0 拷贝 / 7 ml = 1.6 HIV-1 RNA/ml 血浆。
用于计算拷贝数的 Excel 模板表格可从网站下载。
SGS：
如果其中一个阴性对照呈阳性，则应放弃该次实验，因为可能存在污染。每次实验的产物数量取决于每个样本中的病毒载量以及样本的状态。根据我们的经验，血浆中存在大量脂质或细胞会降低获得产物的可能性。样本的储存条件以及先前的冻融次数也会极大地影响RNA的回收率。通常情况下，当处理病毒载量低于50拷贝/毫升的样本时，大约有1/3至1/2的样本能够获得产物（凝胶上的条带）。考虑到上述因素，由于这些患者的病毒载量较低，每块板出现1-5条条带应被视为较好的结果。
| cDNA 合成（逆转录反应体系/cDNA 反应） | 1 次反应 | 无逆转录酶对照（NRT）反应体系/cDNA 反应（1 次反应） |
| 分子级 H2O | 8.1 µL | 8.2 µL |
| 25 mM MgCl2 | 6 µL | 6 µL |
| 25 mM dNTPs | 0.6 µL | 0.6 µL |
| 100 mM DTT | 0.2 µL | 0.2 µL |
| 随机六聚体引物（0.1 µg/µL） | 1.5 µL | 1.5 µL |
| 10X TaqMan Buffer A | 3.0 µL | 3.0 µL |
| RNasin（40 U/µL） | 0.5 µL | 0.5 µL |
| Strategene RT（200 U/µL） | 0.1 µL | 不添加 |
| 总量 | 20 µL | 20 µL |
| 样本 RNA | 10 µL | 10 µL |
| 总体积 | 30 µL | 30 µL |
表1. 单拷贝检测中cDNA合成的反应混合物。
| PCR 扩增主混合液 | 1 个反应 | 引物 |
| H2O | 15.1 µL | HIV 正向引物 5'-CATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGA-3' |
| 10X PCR Gold Buffer | 2.0 µL | HIV 反向引物 5'-TGCTTGATGTCCCCCCACT-3' |
| 25 mM MgCl2 | 2.0 µL | HIV 探针 5'FAM-CCACCCCACAAGATTTAAACACCATGCTAA-TAMRA 3' |
| *正向引物 (100 µM) | 0.3 µL | |
| *反向引物 (100 µM) | 0.3 µL | RCAS 正向引物 5'-GTCAATAGAGAGAGGGATGGACAAA-3' |
| *探针 (100 µM) | 0.05 µL | RCAS 反向引物 5'-TCCACAAGTGTAGCAGAGCCC-3' |
| TaqGold (5 U/µL) | 0.25 µL | RCAS 探针 5'FAM-TGGGTCGGGTGGTCGTGCC-TAMRA 3' |
| 总计 | 20.0 µL |
表2. 单拷贝检测的PCR预混液和引物。
| cDNA 混合液/cDNA 反应 | 1 个 RNA 样本 | 第一轮 PCR 混合液 | 1 块板（75 个反应） | 巢式 PCR 混合液 | 1 块板（75 个反应） |
| 10X RT Buffer (Invitrogen) | 10 µL | 10X PCR buffer (Invitrogen) | 75 µL | 10X PCR buffer | 150 µL |
| 25 mM MgCl2 | 20 µL | 50 mM MgSO4 | 30 µL | 50 mM MgSO4 | 60 µL |
| 0.1 M DTT | 1 µL | 10 mM dNTPs | 15 µL | 10 mM dNTPs | 30 µL |
| RNase-free water | 17.5 µL | 50 µM 引物（每种） | 3 µL | 50 µM 引物（每种） | 6 µL |
| Rnase-Out (Invitrogen) | 1 µL | Platinum Taq Hi Fi Enzyme (Invitrogen) | 6 µL | Platinum Taq Hi Fi Enzyme (Invitrogen) | 12 µL |
| Superscript III (200 U/µL) (Invitrogen) | 0.5 µL | 分子生物学级水 | 468 µL | 分子生物学级水 | 1086 µL |
表1. 单基因组测序的cDNA和PCR反应体系。
| P6-RT 1 PCR 程序 | Env 1 PCR 程序 |
| 1. 94°C 持续 2 分钟 | 1. 94°C 持续 2 分钟 |
| 2. 94°C 持续 30 秒 | 2. 94°C 持续 30 秒 |
| 3. 94°C 持续 30 秒 | 3. 52°C 持续 30 秒 |
| 4. 72°C 持续 1 分钟 30 秒 | 4. 72°C 持续 1 分钟 |
| 5. 返回步骤 #2，共 44 个循环 | 5. 返回步骤 #2，共 44 个循环 |
| 6. 72°C 持续 3 分钟 | 6. 72°C 持续 3 分钟 |
| 7. 4°C 保温 | 7. 4°C 保温 |
| P6-RT 2 PCR 程序 | Env 2 PCR 程序 |
| 1. 94°C 持续 2 分钟 | 1. 94°C 持续 2 分钟 |
| 2. 94°C 持续 30 秒 | 2. 94°C 持续 30 秒 |
| 3. 55°C 持续 30 秒 | 3. 56°C 持续 30 秒 |
| 4. 72°C 持续 1 分钟 | 4. 72°C 持续 45 秒 |
| 5. 返回步骤 #1，共 40 次（总计 41 个循环） | 5. 返回步骤 #1，共 40 次（总计 41 个循环） |
| 6. 72°C 持续 3 分钟 | 6. 72°C 持续 3 分钟 |
| 7. 4°C 保温 | 7. 4°C 保温 |
表4. 单基因组测序实验的PCR扩增仪反应条件。
| 反应 | 引物 | 序列 |
| P6-RT cDNA | 3500- | 5' CTATTAAGTATTTTGATGGGTCATAA 3' |
| env cDNA | E115- | 5'AGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA 3' |
| P6-RT 1. PCR | 3500- | 5' CTATTAAGTATTTTGATGGGTCATAA 3' |
| P6-RT 1. PCR | 1849+ | 5' GATGACAGCATGTCAGGGAG 3' |
| P6-RT 2.PCR | 1870+ | 5' GAGTTTTGGCTGAGGCAATGAG 3' |
| P6-RT 2.PCR | 3410- | 5' CAGTTAGTGGTATTACTTCTGTTAGTGCTT 3' |
| env 1. PCR | E115- | 5'AGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA 3' |
| env 1. PCR | E20+ | 5'GGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAG 3' |
| env 2. PCR | E30+ | 5'GTGTACCCACAGACCCCAGCCCACAAG3' |
| env 2. PCR | E125- | 5'CAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG 3' |
| P6-RT 测序 | 2030+ | 5'TGTTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC 3' |
| P6-RT 测序 | 2600+ | 5'ATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGC3' |
| P6-RT 测序 | 2610- | 5'TTCTTCTGTCAATGGCCATTGTTTAAC3' |
| P6-RT 测序 | 3330- | 5'TTGCCCAATTCAATTTTCCCACTAA 3' |
| env 测序 | E30+ | 5'GTGTACCCACAGACCCCAGCCCACAAG3' |
| env 测序 | E125- | 5'CAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG 3' |
表5. 单基因组测序实验的引物。
图1. 单基因组测序检测（SGS）流程概览。
图 2. 单拷贝检测（SCA）流程概览。
图 3. 单拷贝检测的板式设置。
图 4. 来自 ABI 7700 的截图。A. 显示 HIV-1 RNA 标准曲线及患者样本，B. 显示加入患者样本的 RCAS 标准曲线。
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讨论
接受联合抗逆转录病毒治疗（cART）或自然控制感染的 HIV-1 感染者病毒载量极低，通常约为每毫升血浆 1 个拷贝4, 11, 12, 17, 18。自然控制感染的患者其病毒载量通常在个体特定的设定点附近波动1, 2, 17。本文所述检测方法的灵敏度高度依赖于血浆的输入体积。通常我们使用 7 ml 血浆，但根据实际血浆病毒载量的不同，使用更少量的血浆也可获得阳性结果。本文描述的 RNA 提取方法是一种“自配”方法，较为耗时。我们发现该提取方法非常可靠，且比现有的商业化 RNA 提取试剂盒更有效。血浆质量对获得产物至关重要。血浆先前的冻融过程或在高于 -80 摄氏度的温度下储存会损伤 RNA，降低获得产物的可能性。在超速离心前，强烈建议对血浆进行“预离心”，以去除可能干扰检测的脂质、细胞及其他颗粒物。
该方案中的多个步骤已实现自动化。
SCA检测法相较于其他超敏检测方法具有更高的灵敏度优势。例如，Dornadula等人描述的实时检测法的最低检测限为每毫升血浆5.0拷贝5
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致谢
作者谨此感谢参与众多 HIV-1 研究的患者们。
J.M.C. 曾在美国癌症协会的支持下担任研究员教授，该职位由 F.M. 基尔比基金会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 随机六聚体（500 µg/mL） | Promega Corp. | C118A | |
| Taqman 缓冲液 A | Applied Biosystems | 4304441 | |
| 核糖核酸酶抑制剂 RNAsin（40 U/µL） | Promega Corp. | N211B | |
| 逆转录酶 RT enzyme（200 U/µL） | Stratagene, Agilent Technologies | 600107-51 | |
| Amplitaq Gold DNA 聚合酶 | Applied Biosystems | 4311814 | 6 瓶装 |
| Amplitaq 10X Gold PCR 缓冲液 II | Applied Biosystems | 4311814 | 随酶提供 |
| 氯化镁 25 mM | Applied Biosystems | 4311814 | 随酶提供 |
| 1M Tris-HCl 缓冲液，pH 8.0，5 mM | Invitrogen | AM9855G | |
| Superscript III 逆转录酶，200 U/µL | Invitrogen | 18080-044 | |
| Superscript III 10X 缓冲液 | Invitrogen | 随酶提供 | |
| DTT 100 mM | Invitrogen | 随酶提供 | |
| Platinum Taq DNA 聚合酶高保真酶，5 U/µL | Invitrogen | 11304-102 | |
| 10X 高保真 PCR 缓冲液 | Invitrogen | 11304-102 | 随酶提供 |
| 蛋白酶 K 20 mg/mL | Ambion | 2546 | |
| 硫氰酸胍溶液 6M | Fluka | 50983 | |
| 糖原 20 mg/mL | Roche Group | 10901393001 | |
| 异丙醇 | Sigma-Aldrich | 19516 | |
| 70% 乙醇 | Sigma-Aldrich | E702-3 | |
| 分子生物学级水 | GIBCO, by Life Technologies | 10977-015 | |
| dNTPs（各 25 mmol） | Bioline | BIO-39025 | |
| Easy Seal 离心管（16×73 mm） | Seaton Scientific | 6041 | |
| 白色 Delrin 管盖 | Seaton Scientific | 4020 | Easy Seal 管的盖子 |
| Optiseal 钟形管用试管架，8.9 mL | Beckman Coulter Inc. | 361642 | |
| 六角扳手 ½ 英寸开口 | Seaton Scientific | 4013 | |
| 管盖移除工具 | Seaton Scientific | 4014 | |
| 5 mL 刻度移液管 | Costar | 4051 | |
| Pipetboy 移液控制器 | 任意供应商 | ||
| 15 mL 转移移液管 | ISC Bioexpress | P-5005-7 | |
| 5.8 mL 一次性转移移液管，细尖头 | VWR international | 14670-329 | |
| 15 mL 离心管 | Falcon BD | ||
| 1 mL 离心管 | 任意供应商 | ||
| Tris 缓冲盐溶液片剂 | Sigma-Aldrich | T5030-100TAB | |
| 超速离心机及转子 | Sorvall, Thermo Scientific | 90SE 和 T-1270 | |
| 96 孔 PCR 板 | Bio-Rad | HSS-9601 | |
| 50 mL 试剂储液槽 | Costar | 4870 | |
| Microamp 光学 96 孔反应板 | Applied Biosystems | N801-0560 | |
| 光学板盖 | Applied Biosystems | 4333183 | |
| MicroAmp 光学压缩垫 | Applied Biosystems | 4312639 | |
| Microseal A 膜 | Bio-Rad | MSA-5001 | |
| 2 mL 离心管 | 任意供应商 | ||
| 1% 琼脂糖凝胶（E-gel，Invitrogen） | Invitrogen | G-7008-01 | |
| E-base（Invitrogen） | Invitrogen | EB-M03 | |
| EDTA 采血管，任意品牌 |
参考文献
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