对标准临床检测方法无法检出病毒载量的HIV感染者进行HIV-1 RNA的扩增与定量

摘要

对病毒载量低于检测下限（50-75 拷贝/ml）的个体，其血浆中 HIV-1 RNA 水平的定量以及单个 HIV-1 基因组的测序均较为困难。本文介绍如何利用一种实时 PCR 检测方法提取并定量血浆病毒 RNA，该方法可稳定检测低至 0.3 拷贝/ml 的 HIV-1 RNA，并介绍如何对病毒载量极低的样本进行单基因组扩增测序。

摘要

对于自然控制感染或接受联合抗逆转录病毒治疗（cART）的患者，扩增病毒基因并定量检测病毒载量低于标准检测方法检出限（低于每毫升50-75拷贝）的HIV-1感染者体内的HIV-1 RNA，对于深入了解病毒动力学及病毒与宿主之间的相互作用至关重要。

本文介绍了如何通过单基因组测序（SGS方案）^{13, 19}扩增病毒基因组，以及如何准确量化病毒载量较低患者的HIV-1 RNA（单拷贝检测（SCA）方案）^{12, 20}。

单拷贝检测是一种实时 PCR 检测，其灵敏度取决于所检测血浆的体积。若在 7 ml 血浆中检测到一个病毒基因组，则报告的 RNA 拷贝数为 0.3 拷贝/ml。该检测包含一个内参对照，用于评估 RNA 提取效率，并设有检测 DNA 扩增或污染可能性的对照。患者样本均进行三复孔测定。

单基因组测序检测（SGS）目前已被广泛使用，且被认为操作不繁琐^{3, 7, 12, 14, 15}，它是一种有限稀释法，将终点稀释后的cDNA产物分配至96孔板中。根据泊松分布，当少于1/3的孔产生扩增产物时，该PCR产物来源于单个cDNA分子扩增的概率可达80%。与克隆方法相比，SGS的优势在于不会发生重复取样，且不受PCR过程中引入的重组偏差影响¹⁹。然而，SCA和SGS的扩增成功率依赖于引物设计。这两种检测方法最初均针对HIV-1 B亚型开发，但通过更换引物、探针和标准品，可适用于其他亚型及基因组其他区域。

方案

1. 从大量血浆中提取RNA

单拷贝检测（SCA）和单基因组测序（SGS）方案的概述见图1和图2。

1. 为获得 7 ml 血浆，将采集于 15 ml EDTA（非肝素）采血管中的约 14 ml 血液在 2,600 xg 条件下离心 15 分钟（不启用刹车）。用移液器小心吸取血浆（避免吸取白膜层），转移至 15 ml 离心管中。
2. 若 RNA 将用于单拷贝检测（SCA），需向血浆中加入 30,000 拷贝的劳斯肉瘤病毒内源性病毒对照（RCAS）。RCAS 病毒需在 SCA 检测前按先前所述方法制备（20）。简而言之，从细胞培养上清中收集 RCAS 病毒，通过逆转录酶活性进行定量，稀释至最终浓度为每 200 µl 含 30,000 个病毒颗粒，溶于含 5% FBS 的 RPMI 组织培养基中，并分装保存于 -80°C 单次使用 aliquot 中。RCAS 病毒在用于检测前不得经历冻融循环。将 RCAS 加入患者血浆中，以控制 RNA 提取效率及 PCR 定量的准确性。有关 RCAS 的更多信息，请访问以下链接：http://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/。
3. 将血浆在 15 ml 圆锥形离心管中以 2,600 xg 离心 15 分钟（“预离心”），以去除可能干扰 RNA 准确定量的脂质和细胞碎片....

讨论

接受联合抗逆转录病毒治疗（cART）或自然控制感染的 HIV-1 感染者病毒载量极低，通常约为每毫升血浆 1 个拷贝^{4, 11, 12, 17, 18}。自然控制感染的患者其病毒载量通常在个体特定的设定点附近波动^{1, 2, 17}。本文所述检测方法的灵敏度高度依赖于血浆的输入体积。通常我们使用 7 ml 血浆，但根据实际血浆病毒载量的不同，使用更少量的血浆也可获得阳性结果。本文描述的 RNA 提取方法是一种“自配”方法，较为耗时。我们发现该提取方法非常可靠，且比现有的商业化 RNA 提取试剂盒更有效。血浆质量对获得产物至关重要。血浆先前的冻融过程或在高于 -80 摄氏度的温度下储存会损伤 RNA，降低获得产物的可能性。在超速离心前，强烈建议对血浆进行“预离心”，以去除可能干扰检测的脂质、细胞及其他颗粒物。

该方案中的多个步骤已实现自动化。

SCA检测法相较于其他超敏检测方法具有更高的灵敏度优势。例如，Dornadula等人描述的实时检测法的最低检测限为每毫升血浆5.0拷贝5

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
随机六聚体（500 µg/mL）	Promega Corp.	C118A
Taqman 缓冲液 A	Applied Biosystems	4304441
核糖核酸酶抑制剂 RNAsin（40 U/µL）	Promega Corp.	N211B
逆转录酶 RT enzyme（200 U/µL）	Stratagene, Agilent Technologies	600107-51
Amplitaq Gold DNA 聚合酶	Applied Biosystems	4311814	6 瓶装
Amplitaq 10X Gold PCR 缓冲液 II	Applied Biosystems	4311814	随酶提供
氯化镁 25 mM	Applied Biosystems	4311814	随酶提供
1M Tris-HCl 缓冲液，pH 8.0，5 mM	Invitrogen	AM9855G
Superscript III 逆转录酶，200 U/µL	Invitrogen	18080-044
Superscript III 10X 缓冲液	Invitrogen		随酶提供
DTT 100 mM	Invitrogen		随酶提供
Platinum Taq DNA 聚合酶高保真酶，5 U/µL	Invitrogen	11304-102
10X 高保真 PCR 缓冲液	Invitrogen	11304-102	随酶提供
蛋白酶 K 20 mg/mL	Ambion	2546
硫氰酸胍溶液 6M	Fluka	50983
糖原 20 mg/mL	Roche Group	10901393001
异丙醇	Sigma-Aldrich	19516
70% 乙醇	Sigma-Aldrich	E702-3
分子生物学级水	GIBCO, by Life Technologies	10977-015
dNTPs（各 25 mmol）	Bioline	BIO-39025
Easy Seal 离心管（16×73 mm）	Seaton Scientific	6041
白色 Delrin 管盖	Seaton Scientific	4020	Easy Seal 管的盖子
Optiseal 钟形管用试管架，8.9 mL	Beckman Coulter Inc.	361642
六角扳手 ½ 英寸开口	Seaton Scientific	4013
管盖移除工具	Seaton Scientific	4014
5 mL 刻度移液管	Costar	4051
Pipetboy 移液控制器	任意供应商
15 mL 转移移液管	ISC Bioexpress	P-5005-7
5.8 mL 一次性转移移液管，细尖头	VWR international	14670-329
15 mL 离心管	Falcon BD
1 mL 离心管	任意供应商
Tris 缓冲盐溶液片剂	Sigma-Aldrich	T5030-100TAB
超速离心机及转子	Sorvall, Thermo Scientific	90SE 和 T-1270
96 孔 PCR 板	Bio-Rad	HSS-9601
50 mL 试剂储液槽	Costar	4870
Microamp 光学 96 孔反应板	Applied Biosystems	N801-0560
光学板盖	Applied Biosystems	4333183
MicroAmp 光学压缩垫	Applied Biosystems	4312639
Microseal A 膜	Bio-Rad	MSA-5001
2 mL 离心管	任意供应商
1% 琼脂糖凝胶（E-gel，Invitrogen）	Invitrogen	G-7008-01
E-base（Invitrogen）	Invitrogen	EB-M03
EDTA 采血管，任意品牌