本文展示了两种截然不同的注射方法：1）脑内注射（脑室内注射）和 2）全身性注射（静脉注射），用于将治疗剂导入新生小鼠的中枢神经系统。
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本文内容
摘要
摘要
尽管血脑屏障在保护大脑方面发挥着重要作用，但它限制了治疗药物进入中枢神经系统（CNS），这往往导致针对神经退行性疾病的潜在疗法失败1,2。对于脊髓性肌萎缩症（SMA）等影响下运动神经元的神经退行性疾病，将治疗剂递送至中枢神经系统可带来显著益处。本视频的目的是展示两种不同的注射方法，用于在新生小鼠出生后不久将其治疗物质递送至体内。其中一种方法是直接注射至侧脑室（脑室内注射），通过脑脊液将物质递送至中枢神经系统3,4。第二种方法是颞静脉注射（静脉内注射），可将不同治疗剂引入循环系统，实现包括中枢神经系统在内的全身性递送5。若使用合适的病毒载体和病毒血清型，可实现中枢神经系统的广泛转导。在出生后第6天之前，均可清晰观察并利用颞静脉进行注射。然而，若递送的物质需进入中枢神经系统，则应在血脑屏障尚未发育完全、通透性较高的时期进行注射，最好在出生后第2天之前完成。成熟的血脑屏障会极大限制静脉注射的递送效率。一旦掌握手术技巧，这两种递送方法均简单且有效。它们无需复杂的外科设备，可由单人独立完成。但这些技术也存在挑战。出生后第2天的幼鼠体型微小，靶区范围极小，使得注射操作困难，初期难以重复实现。
方案
1. 脑室内注射
- 第一步是制备注射用储备溶液；这些溶液包括病毒载体、质粒 DNA 和药物，均应在无菌条件下进行注射。
- 将所需滴度的病毒载体（总体积 5–7 μL）与 PBS 中 0.05% w/v 的台盼蓝混合，以便可视化注射部位。
- 质粒 DNA 溶液（总体积 5 μL）包含 D-(+)-葡萄糖 20% (w/v)（1 μL）、0.05% 台盼蓝 PBS（1 μL）、质粒（约 5 μg/μL）（2 μL）以及 2.5 kDa 线性 PEI 均聚物（150 mM）（1 μL）。
- 通过低温麻醉将出生后第 2 天（PND 2）的新生小鼠固定 1–2 分钟。
- 本注射所用的针头为微升级刻度的无菌玻璃微量移液管，通过一根长管连接至 3 mL Hamilton 注射器。
- 用解剖刀片轻敲针尖使其断裂，以调节针头刺入颅骨深度为 2 mm。将针头斜向插入含有注射液的微量离心管中，缓慢拉动注射器活塞，将注射液吸入针头内。
- 吸液完成后，将注射器与导管分离；再向上拉动活塞一段距离，然后重新连接至针头。
- 右手拇指与食指夹持针头，将注射器置于中指与无名指之间，活塞末端接触右手掌心。
- 用左手牢固抓住固定后小鼠头部后方的皮肤，并将其置于光纤光源上，以照亮可用于定位的解剖结构。
- 将针头垂直插入颅骨表面下 2 mm，进针位置位于矢状缝外侧约 0.25 mm，冠状缝前部（吻侧）0.50–0....
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讨论
利用小鼠疾病模型的研究通常需要向新生小鼠注射药物或其他物质。在本视频中，我们演示了两种可用于靶向中枢神经系统的注射策略的逐步操作流程：1）通过脑室内（ICV）注射直接向中枢神经系统给药；或 2）通过颞部/面部静脉进行静脉（IV）注射。注射时机至关重要。由于ICV注射为徒手操作，因此颅骨必须具有相对可塑性。此类注射仅在出生后第一周内可行，随着动物日龄增加，操作将变得愈发困难，并对动物造成更大伤害。然而，其主要优势在于能够直接将药物递送至中枢神经系统，从而有效绕过血脑屏障。因此，若研究者正在开发针对中枢神经系统的治疗药物，则有可能分析那些尚未完全优化药物特性（如血脑屏障通透性）的化合物，但仍可在与疾病相关的组织中检测其活性。在出生后的最初几天内使用颞静脉已被证明具有重要价值，因为这是一种相对非侵入性的常规静脉给药技术。在此发育阶段，其他静脉（例如尾静脉）尚不易触及，而尾静脉通常在出生后第二周才更易于操作5。这两种注射技术均安全可靠，均可徒手完成，小鼠在注射后可迅速恢复，且无任何不良副作用。两种方法均适用于在短时间内快速对一批动物进行注射。它们均需要清晰观察目标区域，以确保注射成功。静脉注射中使用透射照明仪和放大头带（<.......
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致谢
作者谨此感谢 John Marston 在动物饲养管理方面的专业支持，以及 Marco A. Passini 博士在本项目初期阶段提供的技术协助。本研究由美国国立卫生研究院资助，项目编号为 C.L.L.（R01NS41584；R01HD054413）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 绿色食用色素 | McCormick & Co. | n/a | 必须过滤 |
| Hamilton 玻璃注射器 (100 μL) | Sigma-Aldrich | 20702 | |
| LuerMxF 螺纹式白色尼龙接头 | Small Parts, Inc. | VPLF-LC78-1-25 | |
| 细径皮下注射针头 | Popper & Sons, Inc. | 7111 | 规格：33(SWG) × ¼" (6.35 mm) |
| Wee Sight 透射照明器 | Respironics | 1017920 | |
| 2.25倍头戴式放大镜 | MagEyes | 型号 5 | 根据个人偏好选择合适的放大倍数 |
参考文献
- Blanchette, M., Fortin, D. Blood-brain barrier disruption in the treatment of brain tumors. Methods Mol. Biol. 686, 447-463 (2011).
- Foust, K. D., Kaspar, B. K. Over the barrier and through the blood: to CNS delivery we go. Cell Cycle. 24, 4017-4018 (2009).
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