通过脑室内（ICV）和静脉内（IV）注射在小鼠中递送治疗剂

摘要

本文展示了两种截然不同的注射方法：1）脑内注射（脑室内注射）和 2）全身性注射（静脉注射），用于将治疗剂导入新生小鼠的中枢神经系统。

摘要

尽管血脑屏障在保护大脑方面发挥着重要作用，但它限制了治疗药物进入中枢神经系统（CNS），这往往导致针对神经退行性疾病的潜在疗法失败^1,2。对于脊髓性肌萎缩症（SMA）等影响下运动神经元的神经退行性疾病，将治疗剂递送至中枢神经系统可带来显著益处。本视频的目的是展示两种不同的注射方法，用于在新生小鼠出生后不久将其治疗物质递送至体内。其中一种方法是直接注射至侧脑室（脑室内注射），通过脑脊液将物质递送至中枢神经系统^3,4。第二种方法是颞静脉注射（静脉内注射），可将不同治疗剂引入循环系统，实现包括中枢神经系统在内的全身性递送⁵。若使用合适的病毒载体和病毒血清型，可实现中枢神经系统的广泛转导。在出生后第6天之前，均可清晰观察并利用颞静脉进行注射。然而，若递送的物质需进入中枢神经系统，则应在血脑屏障尚未发育完全、通透性较高的时期进行注射，最好在出生后第2天之前完成。成熟的血脑屏障会极大限制静脉注射的递送效率。一旦掌握手术技巧，这两种递送方法均简单且有效。它们无需复杂的外科设备，可由单人独立完成。但这些技术也存在挑战。出生后第2天的幼鼠体型微小，靶区范围极小，使得注射操作困难，初期难以重复实现。

方案

1. 脑室内注射

1. 第一步是制备注射用储备溶液；这些溶液包括病毒载体、质粒 DNA 和药物，均应在无菌条件下进行注射。
2. 将所需滴度的病毒载体（总体积 5–7 μL）与 PBS 中 0.05% w/v 的台盼蓝混合，以便可视化注射部位。
3. 质粒 DNA 溶液（总体积 5 μL）包含 D-(+)-葡萄糖 20% (w/v)（1 μL）、0.05% 台盼蓝 PBS（1 μL）、质粒（约 5 μg/μL）（2 μL）以及 2.5 kDa 线性 PEI 均聚物（150 mM）（1 μL）。
4. 通过低温麻醉将出生后第 2 天（PND 2）的新生小鼠固定 1–2 分钟。
5. 本注射所用的针头为微升级刻度的无菌玻璃微量移液管，通过一根长管连接至 3 mL Hamilton 注射器。
6. 用解剖刀片轻敲针尖使其断裂，以调节针头刺入颅骨深度为 2 mm。将针头斜向插入含有注射液的微量离心管中，缓慢拉动注射器活塞，将注射液吸入针头内。
7. 吸液完成后，将注射器与导管分离；再向上拉动活塞一段距离，然后重新连接至针头。
8. 右手拇指与食指夹持针头，将注射器置于中指与无名指之间，活塞末端接触右手掌心。
9. 用左手牢固抓住固定后小鼠头部后方的皮肤，并将其置于光纤光源上，以照亮可用于定位的解剖结构。
10. 将针头垂直插入颅骨表面下 2 mm，进针位置位于矢状缝外侧约 0.25 mm，冠状缝前部（吻侧）0.50–0.75 mm 处（图 1A）。随后用右手掌心非常缓慢而小心地推动活塞。密切观察是否出现血管破裂或面部肿胀。
11. 停止推动活塞后 15 秒再拔出针头，以防止液体回流。
12. 恢复阶段，将小鼠置于温热容器中 5–10 分钟，直至其活动能力与整体反应性恢复。

2. 经颞部/面部静脉静脉注射

1. 应准备待注射的溶液，并加入过滤后的绿色食用染料，稀释比例为1:100，在无菌条件下进行注射。
2. 将小型塑料鲁尔接头连接至100 μL玻璃哈密尔顿注射器末端，再将33号规格、0.25英寸长的皮下注射针头连接至鲁尔接头。确保所有部件连接牢固。
3. 用待注射体积的溶液装填注射器，确保注射器内无空气，因为将空气注入血管是致命的。通常可将待注射液体移取到一片Parafilm上，有助于清晰观察溶液吸入注射器的过程。
4. 使用Wee Sight透射照明器可方便地观察新生小鼠的浅表颞静脉或面部静脉（图2A）。注射前，使用手术胶带将新生小鼠固定在透射照明器上。应在小鼠与胶带之间放置纱布，以防止胶带损伤动物皮肤。将动物侧向固定于照明器上，确保胶带不妨碍呼吸。轻轻转动小鼠颈部，使面部静脉清晰可见，并用胶带固定鼻部以稳定头部。
5. 佩戴2.25倍头戴式放大镜以增强视野，缓慢将针头插入静脉。静脉位置非常表浅，因此针头应始终在皮肤下可见。
6. 缓慢将溶液注入静脉。绿色染料有助于清晰观察注射过程。
7. 在拔出针头前等待15秒，由于针头内径极细，完全压下注射器推杆与剩余液体完全排出之间存在延迟。
8. 拔出针头后，使用纱布对注射部位施加压力，直至出血停止。
9. 监测新生小鼠是否有痛苦迹象。正确注射后不应出现明显痛苦表现。注射后应让新生小鼠恢复约5分钟，再将其放回笼中。
10. 每次注射之间需用PBS冲洗针头/注射器组件，因为血液残留在细径针头中会迅速造成堵塞。

3. 代表性结果：

脑室内注射：可在注射后的不同时间点取脑，并进行观察以验证注射技术的成功。如果注射溶液中未添加染料，则难以检测注射是否准确。正确地向其中一个脑室注射后，大约在注射后10-15分钟，可在注射侧的大脑观察到台盼蓝的分布（图1B）。大约在注射后60分钟，可在左右两侧大脑半球及嗅球中观察到台盼蓝的均匀分布（图1C）。这是由于脑室之间相互连通，使得蓝色染料能够扩散至相邻的脑室。准确的注射还可通过蓝色染料在注射后约12小时内扩散至脊髓前部中央管来确认（图1D）。若大脑半球中无蓝色显现，则提示注射不准确。此时，可能是针头插入深度不足，导致注射液分布在皮肤下方；另一种可能是针头刺入过深，穿过了脑室，使溶液排入脑室下方区域。

静脉注射：注射后可立即观察到准确且高效的颞部/面部静脉注射效果。当溶液被注入时，绿色染料可使溶液进入面部静脉并沿静脉流动的过程清晰可见（图2A）。此外，注射后可观察到小鼠皮肤颜色发生改变。由于注射液中含有绿色食用染料，新生小鼠原本正常的粉红色皮肤会转变为绿色（图2B）。皮肤变绿的程度取决于所用染料的浓度。在仅需观察注射过程或练习操作时，建议使用1:50的稀释比例。然而，皮肤颜色的显著改变常导致母鼠拒绝幼崽，因此在正式实验过程中应考虑去除染料或大幅降低其浓度。若注射位置不准确，绿色染料将在注射部位皮下积聚。不完全注射是指针头开口未完全进入静脉，此时部分溶液进入静脉而另一部分在皮下积聚，亦可观察到类似现象。若出现上述情况，应将针头进一步插入血管内。

图1. PDN2小鼠脑室内（I.C.V.）注射成功的演示。A) 脑室内注射所用注射位点的示意图。B) 左侧脑室注射含台盼蓝的PBS后的小鼠幼崽脑组织，注射后15分钟拍摄的照片。C) 左侧脑室注射含台盼蓝的PBS后的小鼠幼崽脑组织，注射后60分钟拍摄的照片。D) 左侧脑室注射含台盼蓝的PBS后的小鼠幼崽脑组织，显示前部中央脊髓管，注射后12小时拍摄的照片。

图2. PDN2小鼠成功进行静脉注射的演示。A) 用于静脉注射的面部静脉示意图。B) 通过PBS中的绿色染料进行静脉注射的仔鼠与未注射的同窝仔鼠对比，照片摄于注射后立即拍摄。

讨论

利用小鼠疾病模型的研究通常需要向新生小鼠注射药物或其他物质。在本视频中，我们演示了两种可用于靶向中枢神经系统的注射策略的逐步操作流程：1）通过脑室内（ICV）注射直接向中枢神经系统给药；或 2）通过颞部/面部静脉进行静脉（IV）注射。注射时机至关重要。由于ICV注射为徒手操作，因此颅骨必须具有相对可塑性。此类注射仅在出生后第一周内可行，随着动物日龄增加，操作将变得愈发困难，并对动物造成更大伤害。然而，其主要优势在于能够直接将药物递送至中枢神经系统，从而有效绕过血脑屏障。因此，若研究者正在开发针对中枢神经系统的治疗药物，则有可能分析那些尚未完全优化药物特性（如血脑屏障通透性）的化合物，但仍可在与疾病相关的组织中检测其活性。在出生后的最初几天内使用颞静脉已被证明具有重要价值，因为这是一种相对非侵入性的常规静脉给药技术。在此发育阶段，其他静脉（例如尾静脉）尚不易触及，而尾静脉通常在出生后第二周才更易于操作⁵。这两种注射技术均安全可靠，均可徒手完成，小鼠在注射后可迅速恢复，且无任何不良副作用。两种方法均适用于在短时间内快速对一批动物进行注射。它们均需要清晰观察目标区域，以确保注射成功。静脉注射中使用透射照明仪和放大头带（<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
绿色食用色素	McCormick & Co.	n/a	必须过滤
Hamilton 玻璃注射器 (100 μL)	Sigma-Aldrich	20702
LuerMxF 螺纹式白色尼龙接头	Small Parts, Inc.	VPLF-LC78-1-25
细径皮下注射针头	Popper & Sons, Inc.	7111	规格：33(SWG) × ¼" (6.35 mm)
Wee Sight 透射照明器	Respironics	1017920
2.25倍头戴式放大镜	MagEyes	型号 5	根据个人偏好选择合适的放大倍数