用于血管生成研究的角膜囊袋实验小鼠模型

摘要

角膜的独特之处在于其缺乏血管组织。然而，通过强效的促血管生成因子，可在角膜中诱导出显著的血管生长与存活。因此，角膜可为我们提供一种研究血管生成的宝贵工具。本方案展示了如何开展小鼠角膜囊袋实验模型，以及如何利用该模型评估促血管生成因子所诱导的血管生成。

摘要

正常的角膜不含血管组织。然而，当施加强效的促血管生成因子时，血管可被诱导在角膜中生长并存活¹。这一特性使得角膜囊袋实验成为研究血管生成最常用的模型之一。角膜由多层细胞组成，因此可将含有目标促血管生成因子的药丸植入角膜，以研究其促血管生成作用^2,3。本文中，我们逐步演示如何（I）制备含有促血管生成因子的药丸，（II）将药丸植入角膜，（III）分析目标促血管生成因子所诱导的血管生成。由于碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是已知最强效的促血管生成因子之一⁴，本实验采用bFGF在角膜中诱导血管生成。

方案

所有使用的仪器和试剂均为无菌。本方案已获美国国立眼科研究所/国立卫生研究院动物护理与使用委员会（ACUC）批准（动物实验方案编号 NEI-553），并依照美国国立卫生研究院（NIH）的指南与规定进行。

1. 制备含血管生成因子的微粒

在此步骤中，制备含有目标血管生成因子的颗粒。

1. 用 PBS 配制 10% (w/v) 的硫糖铝溶液，室温保存。
2. 用无水乙醇配制 12% (w/v) 的聚羟基丙烯酸甲酯（poly-HEMA）溶液，室温保存。
3. 配制 1 μg/μl 的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）溶液，于 -80 °C 保存。
4. 为制备 50 个微球，取 5 μl poly-HEMA 溶液、1 μl 硫糖铝溶液和 4 μl bFGF 储存液混合，充分涡旋振荡。
5. 将一片洁净的 Parafilm 膜放入培养皿中，在组织培养超净台内用紫外光照射 15 分钟。每粒微球滴加 0.2 μl 混合溶液至 Parafilm 膜表面，因此 10 μl 混合溶液可制得 50 个微球。室温干燥 1–2 小时。干燥后的微球可在 4 °C 保存数天，或在 -80 °C 保存数月。
6. 使用时，用镊子尖小心撬起并夹取微球，注意避免破碎或弹跳丢失。

2. 小鼠角膜微囊实验的操作

在本部分中，我们将演示如何在小鼠角膜上制作一个囊袋，以及如何将药丸插入该囊袋中。药丸中所含的促血管生成因子将逐渐释放至角膜周围区域（图1）。本实验演示中采用8周龄雌性C57/Bl6小鼠。

1. 小鼠通过腹腔注射氯胺酮（75 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）混合物进行深度全身麻醉。该麻醉状态可持续30–60分钟。将局部麻醉剂（0.5%盐酸丙帕卡因）滴于角膜表面。5分钟后，在体视显微镜下固定一只眼睛。
2. 在角膜缘向内1.2–1.4 mm处的角膜中央，使用冯·格雷费白内障刀（von Graefe cataract knife）进行一次非常轻柔的切口（如图1所示）。务必格外小心，避免切穿角膜。
3. 通过将刀片水平插入角膜中部，并小心地向角膜缘方向延伸，在角膜上皮层下方制作一个囊袋（图1）。囊袋的大小应足以容纳一个含有促血管生成因子的 pellet。操作时需格外小心，避免刺穿角膜。
4. 用镊子将药丸缓慢放入囊袋中，尽量将其压平。
5. 植入药丸后，将局部眼用抗生素软膏涂抹于眼部。在不同动物之间，仪器需用70%酒精棉片擦拭。
6. 将小鼠转移至温暖干燥的区域并进行监测，直至其能够维持直立姿势，然后将其放回原笼中。术后每天两次给予全身性镇痛剂（如布托啡诺，2 mg/kg，腹腔注射）和局部抗生素软膏（如庆大霉素），持续2天，并在术后密切观察小鼠3天。预计术后前48小时内完成愈合。在植入药丸后第4至10天期间，使用裂隙灯生物显微镜检查带有囊袋的眼部。

3. 代表性结果

1. 在 pellet 植入后第 7 天，按照 2.1 节所述方法对小鼠进行全身及局部麻醉。
2. 在解剖显微镜下观察由促血管生成因子诱导的角膜血管。在溶剂处理的角膜中，未见血管生长（图 2A，溶剂处理角膜）。而在 bFGF 处理的角膜中，可见明显的血管生成（图 2B）。可通过测量血管的最大长度（从正常的角膜缘血管至新生血管顶端）以及总血管面积（图 2B 中以红色虚线标示的 bFGF 处理角膜区域）来评估血管生长情况。其他定量方法也已有报道^2,5。

图1. A. 经H&E染色的正常角膜。正常角膜中不存在血管。B. 在角膜上皮层下方制作一个口袋。C. 将药丸植入该口袋中。D. 血管生成因子从药丸中释放，新生血管从正常的角膜缘血管长出。

图2. 植入药丸后第五天的代表性结果。A. 植入仅含载体的药丸的角膜。角膜中无新生血管形成，仅可见原有的正常角膜缘血管。B. 植入含bFGF药丸的角膜。由原有的正常角膜缘血管处长出大量新生血管（点线标示）。

讨论

小鼠角膜囊袋实验模型最初由 Muthukkaruppan VR 和 Auerbach R 于 1979 年描述⁶。不同实验室已发表详细的实验方案^2,3,7,8。我们实验室多年来在研究中对该方法进行了改良和应用⁴。小鼠角膜囊袋实验是一种相对简单且具有良好可重复性的模型。该模型的另一个优点是，由于角膜正常情况下无血管，因此本实验的背景信号极低。因此，该模型被广泛用于研究不同因子和分子的促血管生成作用。与某些较大动物（如大鼠和兔）的眼睛相比，小鼠的眼睛更小，操作难度更高。因此在进行该实验时需格外小心，尤其是在角膜上制作囊袋和插入药丸的过程中。操作刀具时必须精确控制，避免刺穿角膜。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
解剖显微镜	World Precision Instruments, Inc.	PZMIV-BS
Von Graefe 白内障手术刀（1.5×25 mm 刀片，平刃）	安布勒外科	3401E
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11252-50
裂隙灯	卡尔·蔡司股份公司	30 SL-M
<强>表1. 设备
bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）	PeproTech Inc	100-18B
硫糖铝（八硫酸蔗糖）—铝配合物	Sigma-Aldrich	S0652	PBS 中的 10%
聚-HEMA（聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)）	Sigma-Aldrich	P3932	12% 乙醇
<强>表2. 试剂和材料