通过激光扫描光刺激绘制抑制性神经元环路

摘要

本文介绍了一种将激光扫描光刺激与全细胞记录相结合的方法，用于在特定抑制性神经元群体中表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因小鼠。该技术可实现对特定皮层抑制性神经元局部突触环路的广泛定位和定量分析。

摘要

抑制性神经元对皮层功能至关重要。它们约占整个皮层神经元群体的20%，并可根据其免疫化学、形态学和生理学特性进一步细分为多种亚型^1-4。尽管以往的研究已揭示了不同类型抑制性神经元内在特性的诸多方面，但关于它们局部环路连接的知识仍相对有限^3,5,6。鉴于单个神经元的功能由其在皮层环路中的兴奋性和抑制性突触输入所决定，我们一直采用激光扫描光刺激（LSPS）技术来绘制特定抑制性神经元亚型的局部环路连接图谱。与传统的电刺激或谷氨酸喷射刺激相比，LSPS具有独特优势，能够对单个记录神经元的局部功能性输入进行广泛绘制和定量分析^3,7-9。通过谷氨酸解笼技术进行的激光光刺激可选择性地在胞体周围激活神经元，而不激活穿行轴突或远端树突，从而保证了亚层水平的映射分辨率。LSPS在大范围区域内对多个刺激位点输入进行检测的高灵敏度和高效率，使其非常适用于皮层环路分析。

本文介绍了结合全细胞膜片钳技术的局部光解激活（LSPS）方法，用于局部抑制性神经环路的绘制。通过使用在皮层有限抑制性神经元群体中表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因小鼠^3,10，可实现对特定抑制性细胞类型的靶向记录，从而稳定采样目标细胞类型，并明确鉴定所记录细胞的类型。关于LSPS环路作图，我们概述了系统的仪器配置，描述了实验流程与数据采集方法，并展示了在小鼠初级躯体感觉皮层中进行环路作图的实例。如本实验所示，通过紫外激光光解，在脑片的空间限定区域内激活笼锁型谷氨酸；同时进行的电压钳记录可检测光刺激诱发的突触反应。通过扫描激光束刺激数百个潜在的突触前位点，可生成靶向神经元的兴奋性或抑制性突触输入图谱。因此，LSPS技术可通过重复实验，构建特定类型抑制性神经元所接收的突触输入的详细图谱。综上所述，基于光刺激的技术为神经科学家提供了一种强大的工具，用于解析局部皮层环路的功能性组织结构。

方案

1. 脑切片制备

1. 用戊巴比妥钠（>100 mg/kg，腹腔注射）深度麻醉转基因小鼠，迅速断头，并将脑组织取出至冰冷且充氧的切片液中。
2. 使用GFP护目镜进行肉眼筛选，以确认小鼠脑组织是否确实表达GFP。
3. 在含蔗糖的人工脑脊液（ACSF）中，使用振动切片机切割得到400 μm厚的初级躯体感觉皮层切片。切片首先在含蔗糖的ACSF中32°C孵育30分钟至1小时；初始孵育结束后，转移至室温下的记录用ACSF中。在整个孵育和记录过程中，切片持续通入95% O₂-5% CO₂混合气体。

2. 仪器启动

整体系统实现如图1所示。

1. 打开激光冷却系统和电源，使激光器进入准备状态。
2. 开启所有与光刺激控制相关的硬件设备（包括扫描镜系统、光学调制器、电子快门和光电二极管输入放大器）。
3. 开启电生理设备（包括Multiclamp 700B放大器和显微操作器）。电生理记录、光刺激以及脑片样本的成像均在安装于显微镜电动载物台上的脑片灌流室中进行。
4. 开启成像相机（Retiga 2000，Q-imaging，Austin，TX）。通过直立显微镜（BW51X，Olympus）结合红外微分干涉差（DIC）和落射荧光光学系统，利用成像系统观察脑片。
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讨论

基于光刺激的定位技术已成功应用于皮层环路的分析。将激光扫描光刺激与全细胞记录相结合，可实现对单个神经元突触前输入源在皮层各层中分布的高分辨率定位，因为通过同时记录突触后神经元的反应，并在多个不同位置光刺激突触前神经元集群，能够定量评估兴奋性或抑制性输入的空间分布。该技术结合表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因小鼠（其特定抑制性神经元类型已知），极大促进了我们当前对局部抑制性皮层网络的研究。在本示例研究中，我们使用笼锁型谷氨酸盐，通过激光解笼在空间上精确地激活神经元。需要注意的是，谷氨酸解笼可被通道视紫红质或其他基因编码的光敏分子在特定细胞类型中的光激活所替代^12,13。因此，光刺激技术不仅可靶向特定皮层区域，还可靶向参与环路的特定神经元亚群^14-16。此外，我们近期开发了一种新的基于光刺激的定位技术⁹，该技术结合了激光扫描光刺激所能实现的高空间精度，以及电压敏感性染料成像所能实现的快速、高时间分辨率的网络活动检测。与将全细胞记录与光刺激结合以定位单个记录神经元的局部环路输入不同，这一创新技术可用于在神经元群体水平上定位皮层环路的输出及功能连接。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
转基因小鼠品系	杰克逊实验室或其他来源		请参阅Xu和Callaway（2009）
GFP 护目镜	BLS有限公司，匈牙利
振动切片机	徕卡系统	VT1200S
MNI 光笼型谷氨酸（4-甲氧基-7-硝基吲哚啉基-光笼型 L-谷氨酸）	Tocris Bioscience，Ellisville，MO	货号 1490
生物胞素		B4261
电极拉制仪	Sutter Instrument，诺瓦托，加利福尼亚州	P-97
用于制作电极的玻璃管		BF150-86-10
Multiclamp 700B 放大器	Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔	Multiclamp 700B
数字CCD相机	Q-imaging，德克萨斯州奥斯汀市	Retiga 2000
研究显微镜	奥林巴斯，日本东京	BW51X
紫外激光单元	DPSS Lasers，美国加利福尼亚州圣克拉拉	model 3501
激光扫描光刺激的其他设备			请参考 Xu 等 (2010)
溶液：
<李>含蔗糖的人工脑脊液（ACSF），用于脑片切割（单位：mM：85 NaCl，75 sucrose，2.5 KCl，25 glucose，1.25 NaH₂PO₄，24 NaHCO₃，0.5 CaCl₂，7 MgCl₂）2PO4，4 MgCl2，0.5 CaCl2，以及 24 NaHCO₃3).<李>记录用人工脑脊液（ACSF，单位：mM：126 NaCl，2.5 KCl，26 NaHCO₃）3，2 CaCl2，2 MgCl2，1.25 NaH2PO4，以及10葡萄糖）<李>电极内液（单位：mM：126 K-葡萄糖酸盐，4 KCl，10 HEPES，4 ATP-Mg，0.3 GTP-Na 和 10 磷酸肌酸；pH 7.2，300 mOsm）。