通过激光扫描光刺激绘制抑制性神经元环路

摘要

本文介绍了一种将激光扫描光刺激与全细胞记录相结合的方法，用于在特定抑制性神经元群体中表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因小鼠。该技术可实现对特定皮层抑制性神经元局部突触环路的广泛定位和定量分析。

摘要

抑制性神经元对皮层功能至关重要。它们约占整个皮层神经元群体的20%，并可根据其免疫化学、形态学和生理学特性进一步细分为多种亚型^1-4。尽管以往的研究已揭示了不同类型抑制性神经元内在特性的诸多方面，但关于它们局部环路连接的知识仍相对有限^3,5,6。鉴于单个神经元的功能由其在皮层环路中的兴奋性和抑制性突触输入所决定，我们一直采用激光扫描光刺激（LSPS）技术来绘制特定抑制性神经元亚型的局部环路连接图谱。与传统的电刺激或谷氨酸喷射刺激相比，LSPS具有独特优势，能够对单个记录神经元的局部功能性输入进行广泛绘制和定量分析^3,7-9。通过谷氨酸解笼技术进行的激光光刺激可选择性地在胞体周围激活神经元，而不激活穿行轴突或远端树突，从而保证了亚层水平的映射分辨率。LSPS在大范围区域内对多个刺激位点输入进行检测的高灵敏度和高效率，使其非常适用于皮层环路分析。

本文介绍了结合全细胞膜片钳技术的局部光解激活（LSPS）方法，用于局部抑制性神经环路的绘制。通过使用在皮层有限抑制性神经元群体中表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因小鼠^3,10，可实现对特定抑制性细胞类型的靶向记录，从而稳定采样目标细胞类型，并明确鉴定所记录细胞的类型。关于LSPS环路作图，我们概述了系统的仪器配置，描述了实验流程与数据采集方法，并展示了在小鼠初级躯体感觉皮层中进行环路作图的实例。如本实验所示，通过紫外激光光解，在脑片的空间限定区域内激活笼锁型谷氨酸；同时进行的电压钳记录可检测光刺激诱发的突触反应。通过扫描激光束刺激数百个潜在的突触前位点，可生成靶向神经元的兴奋性或抑制性突触输入图谱。因此，LSPS技术可通过重复实验，构建特定类型抑制性神经元所接收的突触输入的详细图谱。综上所述，基于光刺激的技术为神经科学家提供了一种强大的工具，用于解析局部皮层环路的功能性组织结构。

方案

1. 脑切片制备

1. 用戊巴比妥钠（>100 mg/kg，腹腔注射）深度麻醉转基因小鼠，迅速断头，并将脑组织取出至冰冷且充氧的切片液中。
2. 使用GFP护目镜进行肉眼筛选，以确认小鼠脑组织是否确实表达GFP。
3. 在含蔗糖的人工脑脊液（ACSF）中，使用振动切片机切割得到400 μm厚的初级躯体感觉皮层切片。切片首先在含蔗糖的ACSF中32°C孵育30分钟至1小时；初始孵育结束后，转移至室温下的记录用ACSF中。在整个孵育和记录过程中，切片持续通入95% O₂-5% CO₂混合气体。

2. 仪器启动

整体系统实现如图1所示。

1. 打开激光冷却系统和电源，使激光器进入准备状态。
2. 开启所有与光刺激控制相关的硬件设备（包括扫描镜系统、光学调制器、电子快门和光电二极管输入放大器）。
3. 开启电生理设备（包括Multiclamp 700B放大器和显微操作器）。电生理记录、光刺激以及脑片样本的成像均在安装于显微镜电动载物台上的脑片灌流室中进行。
4. 开启成像相机（Retiga 2000，Q-imaging，Austin，TX）。通过直立显微镜（BW51X，Olympus）结合红外微分干涉差（DIC）和落射荧光光学系统，利用成像系统观察脑片。
5. 启动基于Matlab的EPHUS软件和Q-capture相机软件。使用经过自定义修改的Ephus软件版本（Ephus，可从https://openwiki.janelia.org/获取）来控制光刺激方案并采集光刺激数据。
6. 系统启动后，应检查激光光刺激系统是否处于正常工作状态。由于使用4倍物镜传递紫外闪光以实现谷氨酸解笼，可在物镜下方放置一张白纸，在系统运行时观察激光扫描模式。

3. 设置切片灌注

1. 启动加压灌流系统，将记录用人工脑脊液（ACSF）泵入切片室。需注意保持切片室中液面恒定，高出切片约 2.0 mm。
2. 取一份谷氨酸MNI光笼锁化合物（MNI-caged-glutamate）储备液加入 25 ml 循环ACSF中，使光笼锁谷氨酸终浓度为 0.2 mM。请注意，实验进行 5–6 小时后，需更换浴液和MNI-谷氨酸溶液。
3. 将脑切片转移至记录室。可运行成像系统检查切片质量，并在解剖学上定位初级躯体感觉区。随后使用自制的带弦铂金丝环固定切片。注意避免将固定环压在拟用于记录的脑区上。

4. 全细胞膜片钳记录

1. 使用拉制的玻璃电极（电阻为4-6 MΩ），并用含0.1% 生物胞素的内液灌注，用于细胞标记及形态学鉴定。
2. 进行膜片钳记录时，使用60倍物镜观察细胞。首先在DIC/荧光奥林巴斯显微镜下通过观察GFP表达来识别并选择抑制性神经元类型；随后在红外DIC视频监控辅助下进行可视化记录。请注意，在将电极接近目标细胞的过程中，需多次切换DIC与荧光模式，以确认GFP阳性细胞的位置。
3. 采用常规膜片钳技术。电极充以正压，移近细胞表面，使目标细胞膜上形成可见的凹陷；随后迅速施加负压，以形成吉欧封接（gigaseal）并破膜，同时在视频监视器上监测电流注入的响应。
4. 破膜后，采集目标细胞在60倍物镜下DIC与荧光模式的图像，用于在线验证。在采集光刺激数据前，注入超极化和去极化电流脉冲，以检测每个细胞的基本电生理特性。
5. 当获得稳定的全细胞记录且通路电阻良好（通常<20 MΩ）后，将显微镜物镜从60倍切换至4倍，用于激光扫描光刺激。获取4倍下的脑片图像，用于引导和注册光刺激位点。

5. 激光扫描光刺激

1. 通过激活Ephus的配置开关模块来设置光刺激和数据采集参数。通常采用1毫秒激光（20毫瓦），刺激间隔为1秒，用于光刺激定位。以10 kHz采样率采集持续1秒的数据轨迹。
2. 将4倍放大下的脑片图像载入Ephus的定位映射模块。确定细胞胞体的位置，并在该细胞周围设置16×16阵列的光刺激位点（间距为80 μm × 80 μm），覆盖所有皮层层级。
3. 通过在电流钳模式下检测光刺激引发的动作电位位置，绘制所记录神经元的兴奋性反应图谱。我们用户友好的软件具备实时显示功能，有助于定位映射实验的进行。
4. 通过在不同位置进行激光扫描并检测所记录细胞的兴奋性突触后电流（EPSC），绘制局部兴奋性环路连接图。在电压钳模式下将细胞钳制在-70 mV，以检测向内流动的兴奋性电流。重复2-3次EPSC图谱记录，并对光刺激模式进行旋转或翻转以提高可靠性。
5. 可选步骤：也可通过在电压钳模式下将细胞钳制在接近0 mV，检测向外流动的抑制性突触后电流（IPSC），从而绘制局部抑制性环路连接图。请注意，进行IPSC定位映射时，最好使用以铯离子替代钾离子的电极内液。
6. 完成所有生理学检测后，轻柔地将电极从所记录的细胞中撤出。取出脑片并在4%多聚甲醛中固定过夜。利用链霉亲和素标记对所记录细胞进行生物胞素染色，通过共聚焦或落射荧光显微镜观察细胞形态，以确认每个记录的细胞确实是最初靶向的表达GFP的中间神经元。

6. 光刺激数据的分析

我们新开发的方法学和软件实现¹¹被应用于原始数据图中光刺激诱发的突触事件的检测与测量。如图2所示，通过构建颜色编码图来展示记录神经元突触输入的空间分布模式。

7. 代表性结果：

电生理记录与光刺激定位成像的示例结果如图2所示。通过使用在已知抑制性细胞类型中表达GFP的转基因小鼠，可实现对特定抑制性细胞类型的靶向记录。鉴于抑制性中间神经元具有高度多样性，本研究结合GFP表达分析、内在电生理特性及形态学特征（图2A），最终确定细胞类型分类。图2B-C表明，激光扫描光刺激技术能够对单个抑制性神经元的局部皮层环路连接进行广泛 Mapping。原始数据图谱如图2C所示，其中直接解笼响应未纳入数据分析（图2C）。定量输入图谱采用颜色编码，如图2D-F所示。示例中的快速放电型抑制性中间神经元从第4层及更深层接收强烈的兴奋性突触输入（EPSCs）。通过将细胞的突触输入分布模式与明确定义的皮层通路相关联，可推断其在皮层信息处理中的潜在作用（例如反馈性与前馈性抑制）。

图1. 激光扫描光刺激系统的总体仪器配置。 我们的整体系统包括光刺激控制、视频成像和电生理记录系统。我们采用了先前描述的LSPS系统设计^7,17。使用一个激光单元产生355 nm紫外激光，用于谷氨酸解笼。激光束通过系统的光路传输。通过电光调制器（即Pockels盒）和机械快门控制激光脉冲的短时持续时间（例如1–3 ms）。激光束功率通过中性密度梯度轮进行调节，并利用玻璃盖片将一小部分激光束偏转至光电二极管进行监测。激光扫描系统包括一对X-Y扫描镜、扫描透镜、管镜和物镜。扫描镜将激光束引导通过扫描透镜，随后激光束经由二向色镜进入显微镜，并由定制的紫外透射管镜聚焦。激光束未完全充满显微镜物镜的后光瞳，从而形成更接近柱状（而非锥状）的照明光束，通过降低轴向分辨率使映射尽可能保持二维特性。在4倍物镜下，激光束形成的解笼光斑在焦平面上的横向宽度约为153 μm，近似高斯分布（见插图）。通过由检流计驱动的XY扫描镜可实现多种激光刺激位置，由于扫描镜与物镜后光瞳位于共轭平面，镜片位置的变化可转化为物镜焦平面上不同的扫描位置。在解笼过程中，以非光栅、非随机的顺序依次刺激覆盖整个视野的多个特定模式位点，避免重复刺激最近已激活位点的邻近区域。更多详细信息请参见Xu et al. (2010)。

图2. 小鼠初级感觉皮层第4层表达GFP的快速放电中间神经元局部兴奋性环路连接的定位。 A1和A2显示在活体脑片中通过60倍物镜观察到的目标细胞的微分干涉差（DIC）图像和GFP荧光图像，A3显示记录后经生物胞素染色固定的脑片中揭示的细胞形态。A4显示记录的GFP细胞在不同强度胞体内电流注入下的放电模式，具有快速放电抑制性中间神经元的典型特征。B显示叠加了16×16个光刺激位点（*）的脑片图像，细胞位置由小的红色圆圈指示。C显示来自B图中所示刺激位点的光刺激诱发反应迹线阵列，记录时细胞钳制在-70 mV以检测内向兴奋性电流。位置1和2的迹线示例（插图中单独放大显示）展示了不同类型的光刺激反应：迹线1为谷氨酸在细胞体和近端树突解笼时产生的直接反应（红色箭头所示）；其他迹线2为典型的兴奋性突触输入反应（蓝色）。直接反应与突触输入可通过其振幅和反应潜伏期加以区分。D、E和F分别为C图所示原始数据图的平均EPSC振幅、EPSC数量以及每站点首次检测到的EPSC潜伏期的编码彩色图（16×16位点）。每个刺激位点的平均输入振幅为分析时间窗内EPSC振幅的均值，已从同一站点的光刺激反应中减去基线自发反应。每个位点的EPSC数量及首个检测到的EPSC到达时间（潜伏期）也被测量并绘图。更多细节请参见（Shi et al., 2010）。

讨论

基于光刺激的定位技术已成功应用于皮层环路的分析。将激光扫描光刺激与全细胞记录相结合，可实现对单个神经元突触前输入源在皮层各层中分布的高分辨率定位，因为通过同时记录突触后神经元的反应，并在多个不同位置光刺激突触前神经元集群，能够定量评估兴奋性或抑制性输入的空间分布。该技术结合表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因小鼠（其特定抑制性神经元类型已知），极大促进了我们当前对局部抑制性皮层网络的研究。在本示例研究中，我们使用笼锁型谷氨酸盐，通过激光解笼在空间上精确地激活神经元。需要注意的是，谷氨酸解笼可被通道视紫红质或其他基因编码的光敏分子在特定细胞类型中的光激活所替代^12,13。因此，光刺激技术不仅可靶向特定皮层区域，还可靶向参与环路的特定神经元亚群^14-16。此外，我们近期开发了一种新的基于光刺激的定位技术⁹，该技术结合了激光扫描光刺激所能实现的高空间精度，以及电压敏感性染料成像所能实现的快速、高时间分辨率的网络活动检测。与将全细胞记录与光刺激结合以定位单个记录神经元的局部环路输入不同，这一创新技术可用于在神经元群体水平上定位皮层环路的输出及功能连接。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
转基因小鼠品系	杰克逊实验室或其他来源		请参阅Xu和Callaway（2009）
GFP 护目镜	BLS有限公司，匈牙利
振动切片机	徕卡系统	VT1200S
MNI 光笼型谷氨酸（4-甲氧基-7-硝基吲哚啉基-光笼型 L-谷氨酸）	Tocris Bioscience，Ellisville，MO	货号 1490
生物胞素		B4261
电极拉制仪	Sutter Instrument，诺瓦托，加利福尼亚州	P-97
用于制作电极的玻璃管		BF150-86-10
Multiclamp 700B 放大器	Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔	Multiclamp 700B
数字CCD相机	Q-imaging，德克萨斯州奥斯汀市	Retiga 2000
研究显微镜	奥林巴斯，日本东京	BW51X
紫外激光单元	DPSS Lasers，美国加利福尼亚州圣克拉拉	model 3501
激光扫描光刺激的其他设备			请参考 Xu 等 (2010)
溶液：
<李>含蔗糖的人工脑脊液（ACSF），用于脑片切割（单位：mM：85 NaCl，75 sucrose，2.5 KCl，25 glucose，1.25 NaH₂PO₄，24 NaHCO₃，0.5 CaCl₂，7 MgCl₂）2PO4，4 MgCl2，0.5 CaCl2，以及 24 NaHCO₃3).<李>记录用人工脑脊液（ACSF，单位：mM：126 NaCl，2.5 KCl，26 NaHCO₃）3，2 CaCl2，2 MgCl2，1.25 NaH2PO4，以及10葡萄糖）<李>电极内液（单位：mM：126 K-葡萄糖酸盐，4 KCl，10 HEPES，4 ATP-Mg，0.3 GTP-Na 和 10 磷酸肌酸；pH 7.2，300 mOsm）。