量化G蛋白偶联受体上的激动剂活性

摘要

本文描述了一种用于估算激动剂对G蛋白偶联受体活性状态亲和常数（K_b）的方法。该分析可提供K_b的绝对值或相对值，具体取决于受体的组成性激活是否可测量。本方法适用于受体激活后产生的多种下游反应。

摘要

当激动剂激活一群G蛋白偶联受体（GPCRs）时，会引发一条信号通路，最终导致细胞或组织产生反应。该过程可在单个受体、受体群体或下游反应水平上进行分析。本文介绍如何分析下游反应，以估算激动剂对单个受体活性状态的亲和常数。

受体表现为量子化开关，可在活性状态与非活性状态之间交替转换（图1）。活性状态可与特定的G蛋白或其他信号分子伙伴相互作用。在无配体存在时，受体主要处于非活性状态。激动剂的结合会提高受体转换为活性状态的概率，因为其对活性状态的亲和常数（K_b）远大于对非活性状态的亲和常数（K_a）。群体中所有受体随机输出信号的总和，随时间表现为恒定水平的受体激活。引起半最大受体激活的激动剂浓度的倒数，相当于观测到的亲和常数（K_obs），而处于活性状态的激动剂-受体复合物所占的比例定义为效能（ε）（图2）。

已开发出用于分析G蛋白偶联受体（GPCR）下游反应的方法，可用来估算激动剂的K_obs值及其相对效能^1,2。在本报告中，我们展示了如何改进该分析方法，以估算一种激动剂相对于另一种激动剂的K_b值。对于具有组成型活性的检测体系，我们进一步展示了如何以M^-1为绝对单位来估算K_b值。

我们分析激动剂浓度-反应曲线的方法^3,4采用基于操作模型⁵的全局非线性回归。本文描述了使用软件Prism（GraphPad Software, Inc., San Diego, CA）的操作流程。该分析可得到观察解离常数K_obs与一个与效能成正比的参数（τ）的乘积估计值。一种激动剂的τK_obs估计值除以另一种激动剂的对应值，即为K_b (RA_i) ⁶的相对度量。对于任何具有组成性活性的受体，均可估算出一个与游离受体复合物效能成正比的参数（τ_sys）。在此情况下，激动剂的K_b值等于τK_obs/τ_sys ³。

我们的方法可用于确定激动剂对受体亚型的选择性，并可量化激动剂-受体通过不同G蛋白的信号传导。

方案

1. 激动剂浓度-反应曲线的测定：无组成型活性

1. 为了估算相对激动剂的 K_b 值（RA_i），至少需要一系列两条以上的激动剂浓度-反应曲线。只要能够控制激动剂浓度，并且反应由单一类型的受体介导，任何可用于检测 GPCR 功能反应的 体外 实验均可使用。合适的基于细胞的检测方法包括测定表达重组受体的细胞系中 cAMP ^4,7 和肌醇磷酸的累积 ^8,9。整体组织实验的示例包括测定平滑肌的收缩 ¹⁰，或通过场刺激的大鼠左心房中 M₂ 毒蕈碱受体和 β₁-肾上腺素能受体介导的收缩变化 ¹¹。
2. 选择一组包含高效力激动剂（例如内源性配体）在内的激动剂进行分析。在单次实验中，测定每种激动剂的完整浓度-反应曲线。如果激动剂数量过多，无法在一次实验中完成全部检测，则将激动剂分为若干亚组，每个亚组包含可在单次实验中合理处理的激动剂数量。对每个亚组，同时测定高效力激动剂与其他激动剂的浓度-反应曲线（见图3）。根据数据的变异性，每个亚组重复实验约 3 至 6 次。
3. 对每条浓度-反应曲线，测量无激动剂时的反应（基础反应）以及激动剂浓度递增时的反应。激动剂浓度应在对数尺度上均匀分布，间隔约为 0.3 - 0.7 log₁₀ 单位，覆盖整个反应范围并确定最大反应（E_max）（见图3）。对于细胞系实验，每次测量均需设三个重复。
4. 从各激动剂浓度下的测定反应中减去基础反应。图3中绘制的反应值即按此方式计算得出。

2. 激动剂浓度-反应曲线的初步分析：无组成型活性

1. 将浓度-反应实验的数据（例如图5）输入 Prism 中的数据表。所有对数激动剂浓度均输入标为 X 的列中。将具有最大 E_max 值的激动剂的反应测量值输入 A 列，另一激动剂的测量值输入相邻的字母列中。浓度-反应曲线的重复测量值输入至指定字母列的子列中。
2. 选择绘制数据的图表工作表，使用“对数激动剂浓度 vs. 反应 — 可变斜率（四参数）”方程，通过非线性回归分析对数据进行分析。将“Bottom”参数约束为零，并执行回归分析。将“Top”（E_max）和 log EC₅₀ 参数复制到 Excel 电子表格中，用于计算初始参数估计值。将具有最大 E_max 估计值的激动剂指定为“标准激动剂”，其余激动剂则指定为“测试激动剂”。
3. 将标准激动剂的负对数 EC₅₀ 值（-log EC₅₀'）作为 log τK_obs 的初始估计值（LOGR1）进行计算。
   
   将每个测试激动剂的 log RA_i 值（LOGRA）的初始估计值计算为 log {(Top×EC₅₀')/(Top'×EC₅₀)}，其中标准激动剂的参数用撇号表示。
   
   将测试激动剂的对数亲和常数（LOGK2 - LOGK5）计算为其各自 EC₅₀ 值的负对数。

3. 使用非线性回归分析估算激动剂RAi值：无组成型活性

1. 按照上文 2.1 节所述，将数据输入 Prism 中的数据表。确保标准激动剂的数据输入至 A 列。
2. 在 Prism 中输入用户自定义方程“log RAi”，分多行输入，以包含总共五种激动剂的情况为例：
   • P=LOGK1
   • Q=LOGR
   • <~A>Q=LOGR+LOGRA
   • P=LOGK2
   • P=LOGK3
   • P=LOGK4
   • P=LOGK5
   • Y=Msys/(1+{[(1+10^(X+P))/(10^(X+Q))]^M})
3. 按如下方式输入初始参数估计值：
   为标准激动剂的对数亲和常数（LOGK1）输入一个任意低值 0。
   
   输入测试激动剂的 LOGR 初始估计值、亲和常数（LOGK2 - LOGK5）以及对数 RAi 值（LOGRA）。
   
   将换能斜率因子（M）的初始估计值设为 1.0。
   
   将系统最大反应（Msys）的初始估计值设为与标准激动剂的 E_max（Top′）相等的数值。
4. 应用以下参数约束：将 LOGK1 固定为常数 0；LOGR、Msys 和 M 在所有数据集中共享；LOGK2 - LOGK5 和 LOGRA 不设约束。
5. 启动非线性回归分析。结果将得到测试激动剂的对数 K_obs 和对数 RA_i 值。如果标准激动剂为完全激动剂，则对数 K_obs 和对数 RA_i 值均准确。如果最具效能的激动剂（即标准激动剂）实际上为部分激动剂，则效能更高的激动剂的 K_obs 值可能会被高估。尽管如此，在此情况下，对数 RA_i 的估计值仍然准确。
6. 如果回归未能收敛，实验者可尝试绘制由初始参数估计值定义的理论曲线。若数据点与理论曲线之间存在较大偏差，请检查初始参数估计值的计算过程。若一种或多种激动剂的 E_max 值与标准激动剂相当，则可能需要将其对数 K_obs 值约束为 0，以便回归能够收敛至解。

4. 在具有组成型受体活性的基于细胞的检测中测定激动剂浓度-反应曲线

1. 用于激动剂的估算 K_b 以 M 为绝对单位的数值^-1基于细胞的 体外 采用表现出受体组成型活性的检测方法。受体组成型活性定义为表达目的受体后，反应水平较基础状态显著升高。
2. 选择激动剂并按照上述第1.2节所述设计实验。
3. 对于每条浓度-反应曲线，测量非转染细胞在无激动剂存在时的反应（基础反应）以及转染了目标受体的细胞在无激动剂存在时的反应（基础反应 + 组成型反应）。按照第1.3节所述，测量不同激动剂在不同浓度下的反应。
4. 计算组成型受体活性以及每种浓度激动剂的反应，方法为：用转染受体细胞的实测反应减去未转染受体细胞的基础反应。图6展示了针对一条组成型活性极低的信号通路，以该方法计算得到的多种激动剂的反应结果。

5. 具有组成型活性的激动剂浓度-反应曲线的初步分析

1. 将数据（例如图6）输入 Prism 的数据表中，方法如第3.1节所述，同时将由受体组成性活性引起的功能反应输入至对应于激动剂浓度对数为-20的相应字母列中。输入一个较大的负对数值以近似表示激动剂浓度为零的情况。
2. 按照第2.2节中所述方法分析数据，但将“Bottom”参数设定为“所有数据集共享”。复制“顶部" (E_最大），共享“底部”和对数 EC50 将参数输入 Excel 电子表格，用于计算初始参数估计值。
3. 按下述方法计算初始参数估计值：
   
   标准激动剂的对数亲和常数（LOGK1）或任何完全性测试激动剂的对数亲和常数，必须在独立实验中按前述方法测定 ³.
   
   计算对数值的初始估计 K_观察 每个部分激动剂的值（即本例中的仅 LOGK2）为 log {(Top'-Top)/(EC₅₀（上′- 下）}，其中“下”表示由受体组成性激活引起的反应。
   
   计算 log 的初始估计值 K_b (LOGKb) 为每种激动剂的 log {Top/(EC₅₀底部）。
   
   计算对数的初始估计值 τ_sys (LOGTsys) 表示为 log {Bottom/(Top′ - Bottom)}。

6. 使用非线性回归分析估算表现出受体组成型活性的激动剂Kb值

1. 按照上文 3.1 节所述方法，将数据输入 Prism 中的数据表。
2. 在 Prism 中输入用户自定义方程“Log Kb”，分多行输入，以两种激动剂的条件为例：
   • LOGKOBS = LOGK1
   • LOGKOBS = LOGK2
   • A=(10^(X+LOGKOBS))+1
   • B=10^(X+LOGTSYS+LOGKB)
   • C=(10^(LOGTSYS))
   • Y=Msys/{1+[(A/(B+C))^M]}
3. 按以下方式输入初始参数估计值：
   
   输入每种激动剂的亲和常数（LOGK1 — 输入步骤 5.3 中确定的数值）。
   
   输入每种测试激动剂的 K_obs 估计值。
   
   输入激动剂的 Kb 估计值。
   
   输入 log τ_sys（LOGTsys）估计值。
   
   将转导斜率因子（M）和系统最大反应值（Msys）分别设定为 1.0 和 Top'（标准激动剂的 E_max）。
4. 应用以下参数约束条件：LOGTsys、Msys 和 M 对所有数据集采用共享值；LOGK2 和 LOGKb 不设约束。
5. 启动非线性回归分析。结果将提供标准激动剂的 log K_b、部分激动剂的 log K_obs 和 log K_b 值，以及系统最大反应值（Msys）、游离受体复合物的 τ_sys 值（LOGTsys）和操作模型中的转导斜率因子（M）。
6. 如果回归无法收敛，请按照上文第 3.6 节所述步骤进行处理。

7. 代表性结果

图5展示了我们先前发表的部分数据，涉及在稳定表达M₃毒蕈碱受体的中华仓鼠卵巢细胞中，由毒蕈碱激动剂诱导的磷脂酰肌醇水解¹²。本实验测定了若干选定毒蕈碱激动剂的浓度-反应曲线。如第3节所述，对数据进行分析，以估算各激动剂相对于氧托洛尔-M（oxotremorine-M）的K_b值。这些log RA_i估算值分别为：卡巴胆碱（carbachol），-0.56 ± 0.063；槟榔碱（arecoline），-0.60 ± 0.074；匹罗卡品（pilocarpine），-1.20 ± 0.15；以及McN-A-343，-1.92 ± 0.31。理论曲线表示根据回归方程对数据进行最小二乘法拟合的结果（第3.2节）。系统最大反应值（M_sys）和转导斜率因子（M）的相应估算值分别为53.9 ± 1.3和1.15 ± 0.09。除氧托洛尔-M外，各激动剂的log K_obs值分别为：卡巴胆碱，5.19 ± 0.14；槟榔碱，5.49 ± 0.12；匹罗卡品，5.58 ± 0.16；McN-A-343，5.27 ± 0.33。

图6展示了在稳定表达G_α15³的HEK 293细胞中，毒蕈碱激动剂刺激下的磷脂酰肌醇水解实验结果。M₃毒蕈碱受体的瞬时表达导致基础磷脂酰肌醇水解增加，这归因于受体的组成型活性。根据第6节所述方法对数据进行分析，以估算氧化震颤素-M和McN-A-343的log K_b值。该分析得到氧化震颤素-M和McN-A-343的log K_b值分别为8.30 ± 0.59和6.59 ± 0.77。理论曲线表示回归方程对数据的最小二乘拟合结果（见第6.2节）。log τ_sys、M_sys和M的估计值分别为-2.29 ± 0.59、95.8 ± 2.8和0.72 ± 0.08。K_obs值对McN-A-343的估计为5.35 ± 0.46。

图1. 单个受体活性与受体群体平均激活水平之间的关系。单个受体活性，表示在激动剂存在下，单个受体在激活（开启）状态与非激活（关闭）状态之间发生转换的理论行为。激动剂对激活态和非激活态的亲和常数分别用K_b和K_a表示。群体行为，表示在激动剂存在下，多个受体随机在激活态与非激活态之间转换的理论行为。群体平均值，表示在特定浓度激动剂存在下，一群受体中受体激活的平均水平。受体群体的激活水平称为刺激。

图 2. 受体激活函数与激动剂的效能（ε）及观察到的亲和常数（K_obs）之间的关系。群体平均值，显示随着激动剂浓度增加所引发的受体激活平均水平。受体激活，以激动剂的对数浓度为横坐标，绘制受体激活的平均水平。引起半数最大受体激活所需的激动剂负对数浓度相当于激动剂的观察亲和常数的对数（log K_obs）。受体激活函数的最大值定义为效能（ε）。

图 3. 不同毒蕈碱型激动剂在表达人源 M₃ 毒蕈碱受体的中国仓鼠卵巢细胞中对[³H]肌醇磷酸盐累积作用的浓度-反应曲线示例。共测定了九种激动剂的浓度-反应曲线。该实验可分为两个部分，每一部分均将标准激动剂（oxotremorine-M）与其他激动剂同时检测。因此，若每次实验仅能测定五种激动剂，则需进行两轮如图 a 和 b 所示类型的实验，方可完成九种激动剂的浓度-反应曲线测定。数据来自 Ehlert et al. ¹²。

图 4. 不同毒蕈碱型激动剂在表达人源 M₂ 毒蕈碱受体和 G_α15 的 HEK 293 细胞中刺激 [³H]肌醇磷酸盐累积的浓度-反应曲线示例。M₂ 受体的表达引起 30–35% 的 [³H]肌醇磷酸盐反应，归因于受体的组成型活性。数据来自 Ehlert et al. ¹²。

图 5. 稳定表达人源 M₃ 毒蕈碱受体的中国仓鼠卵巢细胞中，毒蕈碱激动剂介导的磷脂酰肌醇水解。图中显示了若干选定的毒蕈碱激动剂刺激磷脂酰肌醇水解的浓度-反应曲线。数据为三次实验的平均值 ± 标准误（SEM）。数据来源于 Ehlert et al. ¹²。

图6. 在表达G_α15和M₃毒蕈碱受体的HEK 293细胞中，氧化震颤素-M和McN-A-343介导的磷脂酰肌醇水解。磷脂酰肌醇水解以氧化震颤素-M的E_max为参照进行表示。在无激动剂存在时，由M₃受体表达引起的磷脂酰肌醇水解约占反应的2%。数据展示为三次实验的平均值±标准误。数据来自Ehlert 等³。

讨论

由于我们估算RA_i（相对K_b值）的方法仅需测定激动剂的浓度-反应曲线，因此只要测定了这些曲线，即可随时进行分析。

如果实验体系（例如细胞或组织）的反应在不同天之间存在较大日间变异，则可将每条浓度-反应曲线的反应测量值相对于当天标准激动剂的“Top”估计值进行归一化。通过回归分析（如第2和第5节所述），对标准激动剂的每条重复浓度-反应曲线分别估算其Top和log EC₅₀值。将当天所有激动剂浓度-反应曲线的反应值相对于该天标准激动剂的Top估计值进行归一化处理。随后，对这些归一化后的数据按照第3节起所述方法进行分析。

准确估算 K_b 依赖于对受体组成型活性的精确测定。在本实验中，将 M₃ 受体转染至 HEK 293 细胞后，导致磷脂酰肌醇水解增加，在使用 [3H]肌醇预标记并加入锂的细胞中测得的 [³