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高效诱导多能人胚胎干细胞生成人心脏前体细胞和心肌细胞的小分子方法

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DOI：

10.3791/3274

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2011年11月3日

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1San Diego Regenerative Medicine Institute, 2Xcelthera, 3Department of Neurosurgery, Harvard Medical School, 4Division of SCI Research, VA Boston Healthcare System, 5Program in Stem Cell & Regenerative Biology, Sanford-Burnham Medical Research Institute, 6La Jolla IVF

本文内容

摘要

我们已建立了一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导心肌母细胞的方案，该方法能够大量获得用于心血管修复的人心脏前体细胞和功能性心肌细胞。

摘要

迄今为止，缺乏合适的人类心肌细胞来源一直是通过细胞移植或心脏组织工程再生人心肌组织的主要障碍1-3心肌细胞在出生后很快进入终末分化状态，并失去增殖能力。目前没有证据表明，来源于其他组织（如骨髓或脐带血）的干细胞/祖细胞在移植到心脏后能够分化为具有收缩功能的心肌细胞。1-3成体干细胞治疗，无论是内源性干细胞还是通过细胞输送的方式，均未能满足心肌损伤后再生或修复的需求。1-3遗传稳定的 人类胚胎干细胞（hESCs）具有无限增殖能力和多向分化潜能，可提供一种多能性细胞资源 体外 获得大量仅限于需要修复和再生的谱系的人体体细胞4,5由于全球心血管疾病的高发以及供体器官的严重短缺，人们迫切希望开发基于人胚胎干细胞（hESC）的治疗方法作为替代策略。然而，如何高效且可预测地引导具有广泛分化潜能的多能hESC定向分化为特定表型，一直是发育生物学研究和临床转化面临的主要挑战。传统方法依赖于多能细胞通过自发的胚层分化产生多谱系倾向，导致谱系定向效率低下且不可控，常伴随表型异质性和不稳定性，因而具有较高的致瘤风险。6-8 （参见示意图） 图 1A此外，通常用于hESCs分离、扩增和分化过程中的未明确成分的外源性/动物源性生物添加剂和/或饲养层细胞，可能使此类细胞特化移植物在患者中的直接应用变得困难9-11为克服这些障碍，我们已确定了一种明确的培养体系所需且充分的组分，该体系可维持人胚胎干细胞（hESCs）上胚层多能性，并可作为后续研究的平台 从头合成 通过小分子诱导获得临床适用的hESCs并有效、均一地将其定向分化为临床相关谱系12 （见示意图于 图 1B）。在筛选了多种小分子和生长因子后，我们发现这种确定的条件使得烟酰胺（NAM）足以直接从多能性人胚胎干细胞诱导心中胚层的特化，随后进一步发育为心原细胞，并高效生成人类搏动的心肌细胞（图 2我们定义了直接从多能性人胚胎干细胞（hESCs）诱导心肌母细胞的条件，无需经过多谱系拟胚体中间阶段，从而能够高效、可控地获得大量涵盖各个发育阶段的人类心肌细胞，用于细胞治疗。

方案

1. 溶液与培养基的配制

  1. 明胶包被液：0.1% (w/v) 明胶溶于ddH2O中，经高压灭菌后于4°C保存。
  2. Matrigel包被液。储存液：于4°C过夜缓慢解冻Matrigel（10 ml），加入10 ml预冷的DMEM或DMEM/F12，充分混匀，在无菌细胞培养超净台中分装为1 ml/管，-20°C保存。工作液：使用前于4°C缓慢解冻1 ml Matrigel分装液1–2小时，立即转移至14 ml预冷的DMEM或DMEM/F12中，在无菌细胞培养超净台中充分混匀后使用。
  3. 人源层粘连蛋白包被液：使用前，在无菌细胞培养超净台中将1 ml人源层粘连蛋白溶液（0.5 mg/ml，溶于Tris缓冲NaCl溶液中，-80°C保存，使用前于4°C缓慢解冻1–2小时）用预冷的DMEM或DMEM/F12稀释至12.5 ml工作液（终浓度40 μg/ml）。
  4. 生长因子储存液（500–1000倍浓缩液）：将生长因子以10 μg/ml浓度溶解于无菌缓冲液（0.5% BSA，1.0 mM DTT，10%甘油，1×PBS）中，分装为50–100 μl/管，-80°C保存。
  5. 人胚胎干细胞（hESC）培养基：DMEM/F12或KO-DMEM（80%）、KO血清替代物（20%）、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或L-谷氨酰胺（2 mM）、MEM非必需氨基酸（MNAA，1×）、β-巯基乙醇（100 μM），过滤后4°C保存，使用前添加20 ng/ml bFGF。或使用成分明确的替代方案：DMEM/F12或KO-DMEM（100%）、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或L-谷氨酰胺（2 mM）、MNAA（1×）、MEM必需氨基酸（MEAA，1×）、β-巯基乙醇（100 μM），过滤后4°C保存，使用前补充bFGF（20 ng/ml）、人胰岛素（20 μg/ml）、抗坏血酸（50 μg/ml）、人激活素A（50 ng/ml）、人白蛋白/Albumax（10 mg/ml）和人转铁蛋白（8 μg/ml）。
  6. 人胚胎干细胞心肌分化培养基：DMEM/F12（90%）、成分明确的胎牛血清（10%）、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或L-谷氨酰胺（2 mM）。
  7. 含烟酰胺（NAM）的培养基：将NAM加入hESC培养基或hESC心肌分化培养基中，使其终浓度为10 mM，过滤后4°C保存，并在配制后2周内使用。

2. 包被平板

  1. 用明胶包被培养板：向6孔板中每孔加入2.5 ml明胶溶液，在37°C恒湿培养箱中孵育过夜。
  2. 用层粘连蛋白包被培养板：将已包被明胶的培养板冷却后去除明胶，向预冷的明胶包被6孔板中每孔加入2.5 ml Matrigel或人源层粘连蛋白工作液，在4°C孵育过夜。

3. 在确定条件下传代和接种未分化 hESC

  1. 让 hESC 克隆生长至 5–7 天，将 hESC 培养板置于解剖显微镜下（解剖台预热至 37°C），并在解剖用无菌罩内操作。
  2. 选择待传代的 hESC 克隆。在形态学上，这些克隆应含有 > 75% 未分化的 hESC（细胞小而致密），通常略呈半透明（非白色堆积状细胞，非透明的已分化细胞），在解剖显微镜下边缘清晰。用 P2 无菌吸头边缘或拉制的玻璃毛细管小心勾勒所选克隆的轮廓，并去除克隆周围分化的成纤维细胞层及克隆中任何已分化的部分。
  3. 通过抽吸去除含有漂浮脱落的已分化细胞的旧培养基。用不含 bFGF 的 hESC 培养基洗涤一次，然后每孔加入 3 ml 含 20 ng/ml bFGF 的新鲜 hESC 培养基。
  4. 将未分化的 hESC 克隆切割成小块，并用无菌吸头或拉制的玻璃毛细管使其脱离。
  5. 将含有脱离克隆片段的培养基收集至 50 ml 锥形管中。用 1 ml/孔含 20 ng/ml bFGF 的 hESC 培养基洗涤培养板一次，并将洗液合并入同一管中。
  6. 从包被好的新培养板中吸除 Matrigel 或人源层粘连蛋白溶液。将含有克隆片段的 hESC 培养基按 4 ml/孔分装至 6 孔板中。轻轻将培养板转移至培养箱，避免震荡，在湿润、37°C、含 5% CO2 的培养箱中静置过夜，使克隆片段贴壁，期间勿扰动。

4. 在含烟酰胺的确定培养体系中诱导hESC向心肌细胞分化

  1. 接种后第3天，吸除孔板中每孔的大部分旧培养基，保留足够量的培养基以确保hESC集落始终浸没在液体中（切勿使hESC干燥）。每孔加入4 ml含有20 ng/ml bFGF和10 mM烟酰胺（NAM）的新鲜hESC培养基。
  2. 每隔一天用含有20 ng/ml bFGF和10 mM NAM的新鲜hESC培养基更换旧培养基，继续培养至诱导心脏分化的hESC集落达到第8–10天。暴露于NAM后，集落内的所有细胞将发生形态学变化，转变为体积较大的分化细胞，并持续增殖。集落体积逐渐增大，至第8–10天时，部分区域的细胞开始出现堆积现象。

5. 悬浮培养中持续进行心脏分化

  1. 将hESC培养板置于解剖显微镜下（预先将解剖台加热至37°C），并在解剖用无菌罩内操作。用P2无菌移液器吸头边缘或拉制的玻璃毛细管小心勾勒出克隆集落轮廓，并去除围绕集落的成纤维细胞层（即从集落迁移出的已分化细胞）。
  2. 吸除含有漂浮脱落成纤维细胞的旧培养基。用不含bFGF的hESC培养基洗涤一次，每孔加入3 ml新鲜的不含bFGF的hESC培养基。
  3. 将心脏诱导的hESC集落切割成小块，并用无菌移液器吸头或拉制的玻璃毛细管使其脱离。
  4. 将含有脱落集落碎片的培养基收集至50 ml锥形管中。用1 ml/孔不含bFGF的hESC培养基洗涤培养板一次，并将洗液一并收集。
  5. 将含有集落碎片的无血清hESC培养基按每孔4 ml分装至6孔超低吸附培养板中，置于37°C、湿润的培养箱中孵育4–5天，以促进悬浮细胞团（心母细胞）的形成。

6. 黏附培养中搏动心肌细胞表型的成熟

  1. 将含有悬浮心母细胞的培养基收集至50 ml锥形管中。以1400 rpm离心5分钟。尽可能吸除旧培养基，并加入等体积含10 mM NAM的新鲜hESC心肌分化培养基。
  2. 轻轻吹打混匀悬浮的心母细胞，按每孔4 ml分装至6孔板中。将培养板转移至37°C、湿润的培养箱中，过夜培养以使心母细胞贴壁。
  3. 每隔一天更换一次含10 mM NAM的hESC心肌分化培养基。
  4. 第8天时，更换为不含NAM的hESC心肌分化培养基，并继续每隔一天更换一次hESC心肌分化培养基。撤除NAM后，持续培养约1–2周即可开始观察到搏动的心肌细胞，其数量随时间逐渐增加，且可持续保持强烈而节律性的收缩超过3个月。

7. 代表性结果：

烟酰胺（NAM）足以诱导在确定培养体系中维持的hESCs从多能性完全转变为心肌中胚层表型（图2B）。当未分化的hESCs暴露于NAM后，集落内的所有细胞均会发生形态学变化，转变为较大的分化细胞，这些细胞下调Oct-4的表达，并开始表达心脏特异性转录因子Csx Nkx2.5和α-肌动蛋白，符合心肌中胚层表型特征（图2B）。这些分化细胞将继续增殖，集落随之增大。通常可在集落中细胞开始堆积的区域观察到Nkx2.5表达强度增强（图2B）。经消化脱离后，经NAM处理的hESCs将在悬浮培养中形成漂浮的细胞团（心母细胞），以继续心脏分化过程。在允许心母细胞贴壁后，持续用NAM处理1周，随后撤除NAM并继续培养约1–2周，即可观察到搏动的心肌细胞，其分化效率相较于未经处理、在相同时间段内自发进行多谱系分化的hESCs显著提高（图2C）。搏动的心肌细胞团内的细胞将表达心肌细胞特征性标志物，包括Nkx2.5和α-肌动蛋白（图2C）。通过电生理记录证实，这些搏动心肌细胞的收缩具有强度高、节律性强、协调性好且同步性佳的特点，其规律性电冲动类似于临床心电图中体表电极所记录的p-QRS-T复合波（图2C，另见视频）。这些心肌细胞可维持强烈的收缩能力超过3个月。

figure-protocol-1
图1．人多能干细胞向特化功能细胞分化的传统方法与小分子诱导方法的整体示意图。（A） 通过人多能干细胞自发性胚层分化实现多谱系倾向的传统方法示意图。（B） 仅通过添加小分子即可高效、精确地将人多能干细胞诱导为特定临床相关谱系的示意图。

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图2. 在定义明确的条件下，烟酰胺可直接诱导多能性细胞向心肌谱系特化，并促进其发育为搏动的心肌细胞。（A） 示意图显示了人胚胎干细胞（hESCs）定向心脏分化的实验流程时间线。（B）在定义明确的培养体系中，未分化的hESCs经烟酰胺（NAM）处理后，相较于对照组中用DMSO模拟处理的hESCs，细胞集落内开始出现大量Oct-4（红色）阴性的分化细胞。这些由NAM诱导产生的Oct-4阴性细胞开始表达Nkx2.5（绿色）和α-肌动蛋白（α-actinin，红色），符合早期心脏分化的特征。在细胞堆积区域，通常可观察到Nkx2.5表达强度逐渐增强。所有细胞核均通过DAPI染色显示为蓝色。（C）经NAM诱导后，定向心脏分化的人胚胎干细胞生成搏动心肌细胞的效率显著提高，表现为出现大量呈现节律性收缩的细胞簇（参见电生理图谱及视频），且免疫染色显示Nkx2.5（绿色）和α-肌动蛋白（α-actinin，红色）呈阳性。图中展示了典型的大片搏动心肌细胞簇的相差图像以及代表性收缩心肌的高倍镜图像（亦见相应视频）。箭头指示用于电生理记录的大片搏动心肌细胞簇。搏动心肌细胞的电生理图谱显示规律、同步的节律性电冲动，类似于临床心电图中观察到的p-QRS-T波复合结构。比例尺：0.1 mm。

视频：由NAM诱导的hESC分化而来的收缩型心肌细胞。视频1和视频2展示了贴壁后约1个月和3个月时具有代表性的大块跳动心肌细胞簇。视频3和视频4展示了高倍镜下具有代表性的收缩性心肌组织。视频5展示了未经NAM处理的hESC自发分化形成的典型小块跳动心肌细胞簇，作为对照。

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讨论

对于发育研究和临床转化而言，一个主要挑战是如何高效且可预测地引导多能性人类干细胞广泛而多向的分化潜能，使其定向分化为特定表型。尽管这些细胞能够自发分化 体外 通过多谱系聚集体阶段分化为所有胚层的细胞，在人胚胎干细胞衍生的多谱系聚集体（类胚体）中，仅有极小部分细胞（<2%）会自发分化为心肌细胞13-15 (图 1A经免疫筛选后，富集的心肌细胞群体在注入动物模型心脏后，能够作为生物起搏器，在机械和电学功能上挽救受损心肌的功能。13在啮齿类动物梗死模型中，移植的人胚胎干细胞来源的心脏前体细胞能够存活并成熟长达12周，部分重建受损心肌并改善心脏收缩功能14,15然而，通过多谱系分化方法从多能细胞生成人心脏定向细胞的效率低下，且移植后存在较高的致瘤风险，这些因素阻碍了其进一步的临床转化。开发能够将多能性人胚胎干细胞（hESC）的广泛分化潜能 exclusively 且可预测地导向心脏表型的策略，对于充分发挥 hESC 生物学在心脏领域的潜力至关重要。为了实现人多能干细胞向特定谱系的均一化转化，我们采用了一种明确的培养体系，在确保未分化 hESC 增殖的同时，探索仅通过添加小分子即可高效、可控地将多能 hESC 特异性诱导为某一具有临床相关谱系的条件图1B我们发现，在确定的培养条件下，烟酰胺可高效地直接诱导多能性hESCs向心肌细胞系分化，并进一步发育为高效搏动的心肌细胞（图 2Nkx2.5 是一种在进化上保守的同源框转录因子，对正常心脏发育至关重要，其基因突变与人类先天性心脏病（CHD）相关，后者是最常见的人类出生缺陷16Nkx2.5 的表达是迄今为止所研究的所有脊椎动物中心脏前体细胞的最早标志物，对于心脏正常分隔以及电传导系统的形成与成熟至关重要。16在脊椎动物中，早期 Nkx2.5 的表达起始时间与表达模式大致与胚胎早期发生中心脏特化的时间和区域相吻合，且 Nkx2.5 基因在心脏发育过程中持续表达16在我们的hESC模型中，NAM似乎通过促进心脏特异性转录因子Nkx2.5的表达，直接从多能性hESC诱导心脏分化，该过程可能模拟了人类胚胎心脏发生过程中从多能性上胚层形成心脏中胚层的特化过程。未来的研究将揭示人类心脏发育中调控基因和表观遗传的控制分子，这些分子可作为替代手段，为小分子介导的直接调控和调节hESC多能性命运提供途径，从而获得用于再生治疗的临床相关细胞谱系。未使用NAM处理时， < 2%的人类胚胎干细胞将自发分化为跳动的心肌细胞12-15通过NAM处理，我们能够生成 > 95% 胚胎心脏前体细胞及 > 50% 跳动的心肌细胞来自在限定培养条件下维持培养的人胚胎干细胞，该过程可能模拟人类胚胎心脏发育12最近，已知的心脏命运决定基因已被用于将小鼠成纤维细胞直接重编程为出生后跳动的心肌细胞，但效率较低 < 0.5%17, 18然而，重编程的体细胞历来存在基因表达异常和加速衰老的问题，从而限制了其治疗应用价值19-21最后，我们在此建立的方案仅限于来源于人类囊胚内细胞团（ICM）或上胚层的多能性hESCs4,5，可能不适用于其他多能性细胞，包括动物来源的胚胎干细胞以及从更早期的桑葚胚（八细胞期）胚胎衍生的胚胎干细胞22以及人工重编程细胞23.

披露

作者声明存在竞争利益。XHP 是 Xcelthera 公司的创始人。XHP 和 EYS 拥有与 hESCs 相关的知识产权。

致谢

XHP 已获得美国国立卫生研究院（NIH）的老年研究所（NIHK01AG024496）和尤妮斯·肯尼迪·施莱弗国立儿童健康与人类发育研究所（NIHR21HD056530）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
明胶Sigma-AldrichG1890
MatrigelBD Biosciences356231生长因子减少型
人层粘连蛋白Sigma-AldrichL6274
烟酰胺Sigma-AldrichN0636
DMEM/F12Invitrogen10565042
DMEMInvitrogen31053036
DMEM-KOInvitrogen10829018
无血清替代物（Knock-out serum replacement）Invitrogen10828028
MEM 非必需氨基酸溶液（MNAA, 100X）Invitrogen11140050
MEM 氨基酸溶液（MEAA, 100X）Invitrogen11130050
β-巯基乙醇（Mercapt–thanol）Invitrogen21985023
白蛋白组分 V 替代物（Albumax）Invitrogen11020021
抗坏血酸Sigma-AldrichA4403
人转铁蛋白Sigma-AldrichT8158
人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）PeproTech IncAF-100-18B
人胰岛素Invitrogen12585014
人激活素 A（activin A）PeproTech Inc120-14E
成分明确的胎牛血清（Defined FBS）HycloneSH30073-03
6 孔超低吸附板Corning3471
6 孔板Corning3516

参考文献

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