Ice-Cap 方法可实现植物在96孔板中生长，并能对每株幼苗的根组织进行非破坏性采样。从这些根组织中提取的 DNA 可用于基因分型反应。我们发现，Ice-Cap 方法在拟南芥（Arabidopsis thaliana）、番茄和水稻幼苗中均具有良好效果。
本文内容
摘要
摘要
植物科学家开展的研究项目中，需要对大量植物进行基因分型的情况日益普遍。任何基因分型项目的首要步骤都是从每个个体植物中采集组织样本。传统的方法是逐个对植株进行取样。然而，若需对数百或数千个个体进行基因分型，该策略将在基因分型流程中造成显著的瓶颈。本文所描述的 Ice-Cap 方法通过使单个科研人员能够在一天内从数千株幼苗中采集组织样本，为这一挑战提供了高通量的解决方案1,2。这种高通量的实现得益于每次同时从96株植物中采集组织，而非逐株取样。
Ice-Cap 方法提供了一个集幼苗培养、组织采集和DNA提取于一体的综合平台。Ice-Cap 的基本原理是在一对堆叠的96孔板中培养幼苗。上层孔板的孔中装有含琼脂培养基的凝胶塞，单个种子在其中萌发成幼苗。幼苗根系向下穿过琼脂培养基，从孔板底部的小孔穿出，进入下方盛有水的下层孔板。采集组织用于DNA提取时，将含有根组织的下层孔板中的水迅速冷冻，而上层孔板中的幼苗仍保持在室温条件下。随后将上层孔板从下层孔板剥离，得到一个含有96份根组织样本并冻结在冰中的孔板，以及另一个含有96株存活幼苗的孔板。该技术被命名为“Ice-Cap”，是因为利用冰来捕获根组织。含有幼苗的96孔板可用铝箔包裹后转移至低温环境，从而暂停幼苗的进一步生长，但不影响其存活能力。在完成基因型分析后，可将具有目标基因型的幼苗从96孔板转移至土壤中进行后续繁殖。我们已以拟南芥（Arabidopsis thaliana）、番茄和水稻幼苗为例，验证了 Ice-Cap 方法的实用性。我们预计该方法也可适用于其他种子足够小、能够放入96孔板孔中的植物物种。
方案
1. 准备含琼脂生长培养基的冰盖幼苗板
使用 MicroFill 微孔板分液器将熔融的培养基（0.5X Murashige 和 Skoog (MS) 基础盐混合物、2 mM Morpholinoethanesulfonic acid (MES)、0.6% 琼脂 (w/v)，pH 5.7）分装至已灭菌的幼苗培养板中。每 18 块幼苗培养板需要 1 升培养基。
- 在带螺旋盖的 1 升玻璃瓶中配制培养基，并高压灭菌 20 分钟。
- 将 1 升去离子水在带螺旋盖的玻璃瓶中高压灭菌，同时将用铝箔包裹的幼苗板（Seedling Plates）空板一同进行高压灭菌。
- 将高压灭菌后的培养基和去离子水转移至设定为 65°C 的培养箱中。此温度可使培养基保持熔融状态。
- 灭菌后，从铝箔中取出幼苗板，并置于超净工作台内晾干。在进行后续操作前，幼苗板必须完全干燥，以确保封口胶带能够完全密封板底各孔的底部。
- 用 95% 乙醇擦拭实验台面以进行消毒。
- 将幼苗板的透明塑料盖浸入 95% 乙醇中进行消毒。取出后在超净工作台中晾干。切勿将塑料盖进行高压灭菌，因为它们会在高压灭菌过程中熔化。
- 在每块幼苗板底部贴上封口胶带，并使用滚轮工具压紧密封。
- 将装有熔融培养基和无菌水的瓶子放入设定为 65°C 的水浴中。
- 将一瓶室温的 70% 乙醇连接至 MicroFill 仪器，并运行两次冲洗循环，以对 MicroFill 仪器的管路系统进行消毒。
- 将无菌水瓶连接至 MicroFill 仪器，运行六次冲洗循环，以预热管路并清除系统中的乙醇。在整个操作过程中，水瓶应始终保持在 65°C 水浴中。
- 完成无菌水冲洗后，立即连接熔融培养基瓶，并运行两次冲洗循环，以清除管路中的去离子水。在整个操作过程中，培养基瓶应始终保持在 65°C 水浴中。
- 向每块幼苗板的孔中分配 450 µL 培养基。操作应迅速进行，以防止培养基在 MicroFill 仪器的管路中凝固。
- 当所有幼苗板加样完成后，立即连接 65°C 的无菌水瓶，并运行 12 次冲洗循环以清洗管路系统。在整个操作过程中，水瓶应始终保持在 65°C 水浴中。
- 若无 MicroFill 仪器，也可使用多通道移液器手动将熔融琼脂加入已密封的幼苗板中。
- 检查每块幼苗板的各孔，确保培养基未从任何孔中泄漏。根据需要，使用移液器向个别孔中补充熔融培养基。
- 用透明塑料盖覆盖每块板，于室温下使培养基在幼苗板中凝固。将板叠放后用铝箔包裹，并倒置存放于 4°C 环境中，以防止储存期间孔内产生冷凝水。
2. 将种子播种至冰盖育苗板并培育幼苗
我们此前已描述了一种用于分液的半自动化方法 拟南芥 使用种子加载装置（2）将种子装入幼苗板中。尽管该装置对某些批次的种子较为适用，但我们发现不同批次种子在种子大小上表现出的变异性 拟南芥 种子的限制性使得该设备的通用性受到一定影响。我们正在开发一种替代性的自动化种子分配方法，但目前发现将种子分配到幼苗板中最有效的方法是按照下述步骤手动操作。
- 将干燥的种子撒在 Whatman 滤纸上。
- 向种子上加入 95% 乙醇，使所有种子均被乙醇覆盖。此处理可对种子表面进行消毒。
- 让种子自然晾干。
- 使用经改造的一次性玻璃巴斯德移液管将单个种子转移至苗板的孔中。巴斯德移液管的末端通过火焰封口形成封闭尖端。将制备好的玻璃尖端轻轻接触琼脂培养基使其湿润，即可轻松吸取单粒种子并转移至苗板各孔中的琼脂表面。也可使用双头版本的该播种工具以提高操作通量。
- 用透明塑料盖盖好每块苗板，并用 Micropore 外科胶带密封。将叠放的苗板用铝箔纸包裹，将拟南芥（Arabidopsis）种子于 4°C 黑暗条件下放置四天以进行春化处理，实现萌发同步化。番茄种子则应在黑暗条件下于 12°C 放置四天。
- 将苗板置于 18° 至 20°C 的荧光灯光下，以启动种子萌发。
3. 将幼苗板转移至冰帽喷泉装置
幼苗板在光照条件下培养四天后，将其转移至 Ice-Cap 喷泉装置中。对于Arabidopsis，幼苗通常在 Ice-Cap 喷泉装置中放置 10 至 14 天。
- 通过将烤盘放置在已置于塑料储物箱内的定制支架结构顶部，组装 Ice-Cap 喷泉装置。使用调平螺母调节烤盘的水平度。在储物箱内放置一台潜水泵，并使用弹簧夹将泵的出水软管固定在烤盘侧面。将 Ice-Cap 喷泉装置置于植物生长室或生长箱内的架子上，确保 Ice-Cap 喷泉表面能接收到直接的荧光照明。
- 用3份蒸馏水与1份自来水的混合液注满 Ice-Cap 喷泉。向喷泉中加水，直至潜水泵位于水面以下数厘米处。使用实验室胶带和记号笔在塑料储物箱上标记最终水位。
- 通过向每块根板（Root Plate）的每个孔中加入一颗直径为3/32英寸的不锈钢球，制备根板。
- 可使用自制的钢球分配装置1将不锈钢球加入根板。该装置的制备方法如下：将一张铝箔覆盖在96孔PCR板表面，用记号笔在铝箔上标记每个孔中心的位置；然后将这张已标记的铝箔覆盖在另外六层铝箔上，并包裹在一个废弃移液枪头盒盖子的光滑表面上。使用尖锐工具（如木签）在96个位置处分别压出可容纳单个金属球的凹坑。向该分配装置中加球时，将过量金属球倒在装置表面并轻轻晃动以去除多余的球。随后将根板置于该分配装置上方，翻转整个装置，使每个根板孔中落入一颗金属球。
- 使用 MicroFill 仪器向每孔根板中加入340 µL的3份蒸馏水与1份自来水的混合液。在加水前，务必确认已将钢球加入根板中。
- 从幼苗板（Seedling Plate）底部剥离压敏胶膜，并取下板上的透明塑料盖。将每块幼苗板放入含有金属球和水的根板中，并使用两条弹性发圈将两块板固定在一起。
- 将叠放的 Ice-Cap 板放入 Ice-Cap 喷泉中。当板放置在 Ice-Cap 喷泉中时，不应使用透明塑料盖。检查幼苗板的A-01孔是否与根板的A-01孔对齐。
- 将叠放的幼苗板/根板留在 Ice-Cap 喷泉中，直至大多数幼苗的根组织已穿透进入根板孔中。Ice-Cap 喷泉中拟南芥（Arabidopsis）幼苗的理想生长温度约为18°C。烤盘中的水位应控制在使水能够流入根板孔中，但又不至于过深导致幼苗板中的幼苗被淹没。若水位不合适，需更换为合适深度的烤盘。
- 定期向 Ice-Cap 喷泉中添加蒸馏水，以维持初始水位。通过向喷泉中添加纯蒸馏水，可补充因蒸发而损失的液体，同时不改变喷泉水体中的矿物质组成。应每天检查 Ice-Cap 喷泉中的水位。
4. 收获根组织
通过将根板中的水冷冻，然后将幼苗板从根板上剥离，从而收获根组织。
- 在收获根组织的前一天，从 Ice-Cap 泉中取出堆叠的 Ice-Cap 板。
- 将三根木签插入堆叠的幼苗板和根板的孔之间。木签的作用是在冷冻前将幼苗板的凸起部分抬离根板的孔，以便后续操作。
- 将插入木签的堆叠 Ice-Cap 板置于光照条件下静置过夜。此孵育过程可使根板中的液体轻微蒸发，从而有利于后续的冷冻和板分离操作。
- 在组织收获当天，准备一个冷冻浴。将一个96孔金属温控块放入玻璃皿中，并加入干冰与95%乙醇的混合物。让温控块在此条件下平衡温度约20分钟。将玻璃皿放置在隔热材料（如灭菌手套）上，以防止低温损伤实验台面。
- 将带有木签的堆叠 Ice-Cap 板放入预冷的温控块中，孵育5分钟。在此期间，根板中的水将完全冻结。而幼苗板中的幼苗不会冻结，仍保持完全活性。
- 从温控块中取出堆叠的 Ice-Cap 板，放置于室温实验台上。移除弹性绑带和木签。用力按压幼苗板顶部，使两板之间产生裂隙，然后小心地将根板和幼苗板分开。
- 让根板中的冰在室温下自然融化。可通过将根板置于25°C温控块中孵育以加速融化过程。
5. 在黑暗条件下将幼苗板置于低温环境中储存
在收获组织后，可将幼苗培养板置于低温黑暗环境中保存，以维持幼苗的活力，同时进行基因型分析。在这些温度下，幼苗可保存数周而不影响其活力。
- 组织收获后，用胶带密封幼苗板的底部。
- 将透明塑料盖盖在幼苗板上方，并用微孔胶带固定。
- 将多个幼苗板叠放在一起，并用铝箔纸包裹。
- 对于拟南芥（Arabidopsis）幼苗，将培养板置于 4°C 环境中；对于番茄幼苗，将培养板置于 12°C 环境中。基因分型完成后，可将幼苗从此低温培养条件下取出，并按如下所述移栽至土壤中。
6. DNA 提取
适用于PCR反应的DNA可轻松从根组织样本中提取。从Arabidopsis根组织样本中回收的总DNA产量平均约为400 ng2。
- 在进行DNA提取操作前，确保根板（Root Plates）中的冰完全融化。检查各孔，判断是否有孔中的水量明显少于平均水平。对于需要补充水分的孔，使用移液器手动加入蒸馏水。
- 使用MicroFill仪器向根板的每个孔中加入25 µL Tris-EDTA溶液（500 mM Tris，pH 8；50 mM EDTA，pH 8）。
- 使用热封膜和热封仪对根板的孔进行密封。
- 将密封后的根板放入GenoGrinder仪器中，密封端朝下放置。此方向可实现最佳珠子运动效果，并防止珠子卡在孔内。在GenoGrinder中以每分钟1350次震荡频率震荡3.5分钟。
- 将板转移至配有微孔板转子的离心机中，在4°C、3500 RPM条件下离心10分钟，使粉碎的根组织沉淀。
- 所得稀释提取液含有基因组DNA，可直接用于PCR反应。通常在PCR反应中加入2 µL该DNA提取液。
- 如需储存DNA样本，使用封口胶带密封微孔板，并置于-20°C保存。DNA样本可在此条件下储存数月，质量无明显下降。
7. 将具有目标基因型的幼苗转移至土壤
基因型分析完成后，可将具有目标基因型的幼苗从幼苗板转移至土壤中。
- 从低温保存处取出幼苗板，并准备装有水分饱和土壤混合物的花盆。
- 使用镊子将单个幼苗从幼苗板中取出，操作时应夹住含幼苗的琼脂块，避免压碎幼苗。用镊子夹住琼脂块，轻轻将其从幼苗板的孔中滑出，注意不要损伤幼苗。或者，也可使用加压空气将琼脂块和幼苗轻轻吹出孔外：对孔底部的小孔施加压力，直至琼脂块弹出并落在实验台面上。
- 在土壤中挖一个与琼脂块大小相匹配的小孔。将琼脂块放入孔中，并用湿润的土壤压实周围，以固定幼苗。切勿试图去除幼苗周围的琼脂。
- 将移栽后的幼苗置于生长室中，在标准生长条件下培养。移栽后前两天用塑料盖覆盖花盆，之后取下盖子，并继续在标准条件下培养植株。
8. 代表性结果：
Arabidopsis 幼苗使用 Ice-Cap 系统培养的一个示例如图 4A 所示。拍摄照片时，这些幼苗已在 Ice-Cap 喷泉装置中生长了两周，已准备进行组织收获。这些相同幼苗的根组织如图 4B 所示。从一份 Arabidopsis 根组织样品中提取的总 DNA 量通常在 100 ng 至 700 ng 范围内2。该产量计算仅基于粗制根提取物的一部分。由于 DNA 提取过程通常仅使用粗制根提取物的大约 10%，若保留更多的粗制提取物，则有可能获得显著更多的基因组 DNA 用于下游分析。采用 Ice-Cap 方法获得的基因组 DNA 总量足以进行数百次 PCR 反应2。
图 1： Ice-Cap 操作流程图。A) 种苗板，内含琼脂生长培养基，用于幼苗萌发。根系穿透琼脂并向板底部生长。板孔底部的孔洞用粘性膜密封。B) 种苗板叠放在根板上方，根板内含有水和一个金属球。根系从种苗板孔底的小孔中伸出，并生长进入根板的孔中。C) 在将叠放的 Ice-Cap 板放入干冰/乙醇浴中的温控块之前一天，将木签插入种苗板与根板之间。D) 当根板中的水完全冻结后，将种苗板从根板上剥离，得到含有 96 个组织样本的根板和含有 96 株存活幼苗的种苗板。此步骤中，木签有助于两块板的分离。
图 2：幼苗板与根系板照片。A）单独放置的幼苗板与根系板。B）幼苗板堆叠在根系板上方。根系板孔中的钢珠用于DNA提取。使用弹性绑带将两块板固定在一起。
图3： Ice-Cap 喷泉装置。Ice-Cap 喷泉用于维持 Root Plate 培养板孔口顶部高度处的恒定水位。该连续供水系统可确保 Root Plate 孔中的水不会因蒸发或蒸腾作用而耗尽。A) 一个自制支架，用于支撑放置堆叠式 Ice-Cap 板的烤盘。B) 提供精确调节烤盘水平功能的 1 英寸螺母的特写图，以确保喷泉表面的水深均匀。C) 本图展示了构建 Ice-Cap 喷泉用自制支架所需的全部组件。D) 组装完成的 Ice-Cap 喷泉。一个潜水式喷泉泵持续将水从下部储水槽泵送至烤盘，烤盘放置在自制支架上方。使用弹簧加载夹具将软管固定在烤盘边缘。
图4： 利用Ice-Cap方法培养的Arabidopsis幼苗。A）从上方俯视Seedling Plate的两个孔，每个孔中含有一株Arabidopsis幼苗。B）Root Plate两个孔的侧面视图，可见根部在孔内表面盘绕生长。本图中的幼苗已在Ice-Cap Fountain中培养约两周，处于通常进行组织采收的生长阶段。
讨论
本文介绍的冰盖法（Ice-Cap）使一位科研人员能够在一天内从数百甚至数千株独立植物中采集组织样本，并高效提取这些样本的基因组DNA，用于基因分型反应。该方法使单个科研人员能够在短时间内对数千株幼苗进行基因分型，从而有望推动多种原本难以实际开展的遗传学实验。以下提供若干示例。
- 遗传作图。如果研究人员能够识别染色体上特定区间内的重组事件，则可加快精细遗传作图的进程3。若该区间遗传距离非常短，则在分离的作图群体中重组事件将相对罕见。因此，可能需要筛选数千个个体植株才能找到所需的重组个体。通过使用Ice-Cap技术，这一过程可得到极大加速。即使在全基因组重测序时代，仍需直接证明某个突变确实导致了感兴趣的表型。在这些情况下，必须将目标突变与其他紧密连锁的突变分离，以证实候选突变确实是致病突变。在这些情形下，Ice-Cap将提供一种高效的方法，用于打破一对紧密连锁突变之间的连锁关系。
- 多突变体。在研究拟南芥（Arabidopsis）时，研究人员常将来自多个不同位点的突变等位基因组合到同一个个体中，以克服功能冗余4-6。例如，设想需要通过遗传杂交将四个不同位点的突变等位基因组合到单个植株中。在此项目中，必须在杂交方案中产生在这四个位点均为杂合的个体。当该四重杂合子植株结籽时，预期在后代群体中四重纯合子的出现频率为1/256。采用传统方法筛选这种稀有个体将极为耗时费力。相比之下，在该项目中使用Ice-Cap技术，可为科研人员提供一种高效的策略，在单一代次中快速鉴定出稀有的四重纯合子。
- iTILLING。我们实验室近期描述了一种在拟南芥（Arabidopsis）中筛选目标基因诱导突变的新方法7。该方法是对一种称为TILLING的成熟技术的改进，TILLING用于在经化学诱变处理的有序个体群体中寻找突变8-10。我们将该方法命名为iTILLING，因为它是TILLING的个体化版本，使单个科研人员即可完成以往需要大型研究团队才能实现的任务。如后文所述，Ice-Cap是iTILLING方法中不可或缺的组成部分7。
iTILLING 的核心思想是创建一个短暂的突变体群体，这与传统 TILLING 项目所建立的持久性突变体群体形成对比。在 iTILLING 中，将混合 M2 代群体的种子播种到 50 至 100 个 Ice Cap 板块中，并采用 Ice-Cap 方法提取 DNA。Arabidopsis 幼苗随后置于 4°C 条件下，同时利用 Ice-Cap 法制备的 DNA 进行突变筛查。番茄幼苗则储存在 12°C 条件下。一旦鉴定出携带目标突变的幼苗，便从 Ice-Cap 培养板中回收并转移至土壤中培养。iTILLING 并非旨在为整个科研群体提供可长期使用的突变体资源用于广泛筛选，而是为单个研究人员提供一种策略，使其能够快速、高效且以相对较低的成本，在自定义的突变体群体中对少数几个基因进行突变筛选。
我们发现 Ice-Cap 是一种用于种植和进行基因分型的有效方法，适用于Arabidopsis（拟南芥）、番茄和水稻。我们预计其他植物物种也应适用于 Ice-Cap。Ice-Cap 可容纳的物种种类存在一个限制因素，即种子的大小。只有种子足够小、能够放入 96 孔板孔中的植物，才适用于当前配置下的 Ice-Cap。
致谢
本研究由美国国家科学基金会资助（资助编号 MCB-0447750）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| GenoGrinder | Spex/CertiPrep，新泽西州梅图亨 | 2000 Geno/Grinder | 用于震荡根板以进行DNA提取的仪器 |
| ABgene Thermo-Sealer | ABgene Limited | AB-0384 | 在组织破碎前用于手动热封根板的设备 |
| 配备摆动式微孔板转子的离心机 | Beckman Coulter Inc. | Allegra 25R | 任何配备摆动式微孔板转子的离心机均可适用 |
| MicroFill 微孔板分液仪 | BioTek | AF1000A | 用于自动填充微孔板的液体分液装置 |
| Bialetti 品牌 17×11 英寸商用大型烤盘 | Target 百货商店 | www.bialetti.com | 该特定烤盘的深度非常适合 Ice-Cap 实验 |
| 定制金属架 | 五金商店 | 详见正文描述 | |
| 33 升塑料储物箱 | Target 百货商店 | Sterilite 品牌 | 用于 Ice-Cap 喷泉装置。 塑料储物箱需足够大，以容纳 17×11 英寸的烤盘 |
| 每小时 30 加仑喷泉泵 | Sunterra | 104506 | 可在园艺用品店购买的小型潜水喷泉泵 |
| 喷泉泵软管 | 任意供应商 | 与喷泉泵兼容的软管 | |
| 塑料夹 | 五金商店 | 用于将软管固定在烤盘上 | |
| Falcon Microtest 平底 96 孔聚苯乙烯板透明塑料盖 | BD Biosciences | 351172 | 用于覆盖 Ice-Cap 幼苗板的透明塑料盖 |
| 3M Micropore 外科胶带 | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| 直径 3/32 英寸的不锈钢珠 | Hartford Technologies，康涅狄格州罗基希尔 | 034-006-1K | 收获后用于破坏根组织 |
| 3 英寸弹性发圈 | 本地杂货店 | 用于固定根板与幼苗板 | |
| 直径 4 mm 的木签 | 本地杂货店 | 这些木签通常用于制备串烧 | |
| Fisher Scientific Nunc 品牌，1 mL 无烧结滤膜过滤板 | Fisher Scientific | 278012 | 底部带孔的 96 孔幼苗板 |
| Fisherbrand 96 孔高烟囱 PCR 板 | Fisher Scientific | 14-230-242 | 96 孔根板 |
| 琼脂 —— 细胞培养测试级 | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| 4-吗啉–乙磺酸 (MES) | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Murashige 和 Skoog (MS) 基本盐混合物 | Sigma-Aldrich | M-5524 | |
| Easy Peel 热封箔 | ABgene Limited | AB-0745 | 在组织破碎前用于密封根板的热封膜 |
| Duck Brand 超宽包装胶带，3.00" × 54.6 码 | Office Max | 货号 21242139 | 用于密封含有 DNA 提取物的微孔板以便储存的压敏胶带 |
| 封膜滚压器 | Bio-Rad | MSR-0001 | 手持式滚压工具，用于将压敏封膜平整地压贴到微孔板上 |
| 96 孔金属热传导块 | Cole-Parmer | 36400-66 | 用于在组织收获前冷冻根板 |
| Whatman 滤纸 | Whatman, GE Healthcare | 1002 090 | 用于种子表面灭菌 |
| 一次性巴斯德吸管 | Fisher Scientific | 13-678-6A | 5¾" 一次性巴斯德吸管，用于将种子转移至幼苗板 |
| Pyrex 烤盘（20 cm × 30 cm） | Target 百货商店 | 用于构建干冰/乙醇浴 | |
参考文献
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重印与许可
