小鼠颈动脉套管植入以诱导剪切应力介导的动脉粥样硬化

摘要

本文介绍的缩窄套管旨在诱导小鼠颈总动脉发生动脉粥样硬化。由于其内腔呈锥形结构，植入后的套管可产生明确的低、高及振荡剪切应力区域，从而触发具有不同炎症表型的动脉粥样硬化病变的形成。

摘要

普遍认为，血管剪切应力的改变会触发内皮细胞中炎症相关基因的表达，从而诱导动脉粥样硬化的发生（详见综述于 ¹ 和 ²）。剪切应力的作用已被广泛研究 体外 研究流体动力学对培养的内皮细胞的影响 ^1,3,4 和 体内 在较大的动物和人类中 ^1,5,6,7,8然而，能够系统研究剪切应力对斑块形成影响的高可重复性小型动物模型十分罕见。最近，Nam 等人 ⁹ 引入了一种小鼠模型，通过结扎颈动脉分支产生低流速和振荡流区域。尽管该模型可在高脂血症小鼠中引起内皮功能障碍并快速形成动脉粥样硬化病变，但尚不能排除所观察到的炎症反应至少部分归因于结扎所致的内皮和/或血管损伤。

为了避免上述局限性，基于计算流体动力学设计了一种可调节剪切应力的套管，其内腔呈锥形，旨在颈总动脉内形成明确的低、高及振荡性剪切应力区域 ¹⁰通过在喂食高胆固醇西方饮食的载脂蛋白E（ApoE）基因敲除小鼠中应用该模型，可在套管的上游和下游形成血管病变。其表型与局部血流动力学相关。 ¹¹ 经证实 体内 磁共振成像（MRI） ¹²颈动脉套管上游的低而层流剪切应力导致形成表型更易损的广泛斑块，而套管下游的振荡剪切应力则诱导产生稳定的动脉粥样硬化病变 ¹¹在袖带内高剪切应力和高层流区域，通常观察不到动脉粥样硬化斑块。

综上所述，剪切应力调控套管手术是一种可靠的外科方法，可在载脂蛋白E缺陷小鼠中诱导表型不同的动脉粥样硬化病变。

方案

1. 准备剪切应力调节器（套管）

1. 剪切应力调节剂 由两个纵向的圆柱半壳组成，其内腔呈圆锥形。半壳由通过塑料铸造工艺制成的热塑性聚醚酮构成。铸造部件在仍与流道连接的状态下被送出，因此在使用前需将半壳从流道上切割下来。每件铸件包含不同尺寸的半壳，尺寸范围从 150 μm - 300 μm （下游末端最小内径）
2. 套管制备应在手术显微镜下进行。
3. 用钝头镊子夹住套管半壳，用锋利的手术刀小心地将其从铸型上切下。该操作将得到需要进一步加工的半壳前体。
4. 将半壳前体放置于平整的防滑平板上，用钝头镊子固定，沿预切口精确切割以去除封闭端，即可得到可用于实验的袖套半壳。
5. 在显微镜下控制半壳结构，轻轻去除任何残留的锋利边缘。圆锥形的内腔对于在植入套管的上游和下游区域诱导不同特性的剪切应力至关重要。半壳外表面有一条垂直于内腔的凹槽，用作缝合线的导向槽，最终将两个半壳固定在一起形成功能性套管。
6. 将按尺寸分类的袖带半壳保存在70%乙醇中。

2. 在右侧颈动脉周围植入套管

1. ApoE 基因敲除小鼠的年龄应约为 10 周，体重至少为 20 克。若需在高胆固醇饮食条件下研究斑块形成，建议在颈动脉套管植入术前 4 周开始喂食西方型高脂饮食。
2. 整个手术操作应在至少半无菌条件下进行：穿戴手术服、口罩、帽子及无菌手套。将器械在干热灭菌器中灭菌 30 秒后，置于无菌不透明敷布上。注意！使用前必须确保器械已冷却！
3. 将小鼠置于充满 3% 异氟烷的麻醉诱导舱内，直至其完全麻醉。通过脚趾夹捏反应判断麻醉深度。也可采用腹腔注射（i.p.）给予氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉，或其他经 IACUC 批准的麻醉剂。进行腹腔注射时，将小鼠仰卧固定，并将麻醉剂注入腹部左下象限。
4. 将小鼠仰卧位固定于加热的手术板上。为防止眼睛干涩，使用眼膏（如 Bepanthen 眼鼻霜）润湿角膜。展开前后肢并用胶带固定于手术板上。若采用异氟烷麻醉，需通过小型啮齿类动物面罩持续供给麻醉气体（2% 异氟烷）。
5. 使用脱毛剂（如 Pilca Med）或精细电动剃须刀（如 Wella Contura）去除下颌至胸骨之间的毛发。剃毛时应小心操作，避免刺激皮肤。若使用脱毛剂，需停留 1–2 分钟使其软化毛发，随后轻轻擦拭直至毛发及脱毛剂完全清除。
6. 预先准备好不同尺寸的套管半壳（每种尺寸各两个）以及一段长 2.5 cm 的 6-0 丝线，用于在颈动脉阻塞部位连接两个半壳。
7. 用足量的聚维酮碘对术区进行消毒。使用锋利的小剪刀从胸骨（manubrium）顶端开始，沿中线做 4–5 mm 的纵向切口，切开皮肤及皮下筋膜。
8. 扩大切口，将右侧腮腺向一侧推开，插入外科牵开器。沿气管左侧（术者视角）钝性分离深层组织，直至右侧胸锁乳突肌与肩胛舌骨肌交叉区域，辨识出搏动的右侧颈总动脉。
9. 使用极细的弯头或弧形镊子（如 Dumont #5/45），轻柔剥离右侧颈总动脉周围的结缔组织。将颈动脉与迷走神经（紧贴颈动脉走行的白色细线状结构）分离，此步骤对充分暴露血管至关重要。操作时需避免损伤迷走神经或左侧颈内静脉的分支，后者亦与颈动脉邻近。
10. 为选择合适的套管尺寸，需将暴露的颈总动脉直径与套管半壳的内径进行比较：套管腔的最大宽度应与颈总动脉的外径相匹配。
11. 将镊子尖端小心置于颈总动脉下方，张开镊子，将 6-0 丝线从动脉下方穿过并形成环状。在丝线环与颈总动脉之间，将一个套管半壳置于动脉下方，其最狭窄端必须朝向远端（下游方向）。
12. 将第二个套管半壳放入丝线环内，置于颈总动脉上方。
13. 使用持针器轻柔收紧丝线环并打结。通过此操作形成具有功能的剪切应力调节装置。为确保套管精确贴合，丝线必须准确嵌入套管外表面的预制凹槽内。
14. 将右侧腮腺复位，使用少量 6-0 丙烯缝线或伤口夹闭合皮肤切口。
15. 皮下注射单剂量 5 mg/kg 的卡洛芬（如 Rimadyl），以进行预防性镇痛处理，并将小鼠置于保温舱内直至苏醒。使用氯胺酮/赛拉嗪麻醉时，通常需 30–60 分钟恢复；若采用异氟烷吸入麻醉，恢复时间显著缩短（10–20 分钟）。
16. 根据我们的经验，由经验丰富的外科医生操作时，动物通常在套管植入术后 24 小时内恢复正常的非应激活动状态。然而，若动物术后一天仍表现出痛苦迹象，应重复给予镇痛治疗并咨询兽医人员。

3. 剥离套管及颈动脉

1. 进行组织学分析时，需在观察期结束时取材颈动脉。在开始取材前，必须根据IACUC指南将动物处死。
2. 若计划重复使用套管半壳，请仔细从塑料部件上清除所有组织碎片以及连接缝线，这些部件需从颈动脉上分离；随后清洗，并将半壳保存于70%酒精溶液中。需要注意的是，套管在植入数周后会嵌入结缔组织粘连中，因此在分离时需谨慎操作，避免损伤血管壁。
3. 或者，也可将套管连同颈动脉一同取出并共同包埋。套管的塑料材料可耐受常规固定液及石蜡包埋所用的溶剂。此外，包埋后的样本可使用配备普通刀片的常规切片机进行切片。

4. 代表性结果

必须将套管始终放置在动物两条颈总动脉之一的周围（图1A、1B）——对侧作为对照。在显示套管两个半壳的图像中（图1B），可观察到内腔的锥形结构。这种锥形结构对于形成具有不同血流动力学特征的三个区域至关重要。图2给出了根据多普勒测量结果计算出的铸型所诱导的典型剪切应力分布¹¹，以及基于相位对比速度磁共振成像得出的相应血流速度¹²。

当在喂食西方型饮食的ApoE基因敲除小鼠体内植入套管时，血流动力学的改变会引发剪切应力诱导的动脉粥样硬化斑块沉积（图3）：在锥形缩窄段上游，低层流剪切应力导致更易破裂表型的动脉粥样硬化斑块大量形成，其特征是脂质核心靠近管腔中央，仅由一层薄的纤维帽覆盖（图3A1）。套管的锥形内腔使血流速度增加，在该区域几乎不观察到斑块沉积。在狭窄部位正下游，动脉立即扩张，形成涡流和振荡性血流参数区域，从而导致范围较小、表型更稳定的斑块形成（即脂质核心较少，且更靠近中膜分布）。

图1. 剪切应力调节套管——组装与放置。 （A）植入套管的示意图：套管置于右颈总动脉（RCCA）周围，对侧（LCCA = 左颈总动脉）作为对照。 （B）小鼠体内磁共振血管成像（MRI）：在三维时间飞跃法磁共振血管成像的最大强度投影图中，可见模具引起的锥形狭窄（白色箭头）（详见¹²）。 （H=头端，F=足端，R=右侧，L=左侧）。右上角显示套管半壳内腔及外表面的宏观视图。两个半壳组装后形成一个锥形圆筒，可精确调控血管内的血流动力学。为确保正确贴合，套管外表面的凹槽（黄色箭头）可作为缝合连接的引导标记。

图2. 不同血流动力学和剪切应力区域。 套管的植入以特定方式改变了狭窄颈动脉中的血流动力学，进而影响剪切应力。上方的示意图中标示了不同的血流特性，并给出了剪切应力的局部近似值（基于多普勒测量结果¹¹）。下方显示的是通过MRI在套管植入上游位置测量的单只动物对应的血流速度，图像为颈部的T1加权横断面MRI图像（相位对比速度成像，详见¹²）。

图3. 在ApoE基因敲除小鼠中由剪切应力诱导的斑块形成。 左上角显示的是在高脂（西方饮食型）饮食下，于右颈总动脉（RCCA）周围植入剪切应力调节套管8周后，ApoE基因敲除小鼠颈部打开后暴露的颈动脉宏观图像。血管（*）套管上游的不透明白色区域对应着大量动脉粥样硬化斑块沉积的部位。黄色箭头指示连接两个半套管的缝合线。相比之下，左颈总动脉（LCCA）未见斑块沉积迹象。
（A）–（C）为在西方饮食型饮食下，ApoE基因敲除小鼠植入套管8周后右颈总动脉的代表性苏木精-伊红（HE）染色横切面。示意图中标出的虚线表示各切片所对应的解剖平面。（A）在套管上游，动脉粥样硬化导致显著的斑块沉积。大的脂质核心（红色箭头），部分靠近管腔中央（细节A1），提示这些斑块具有易损特征。（B）在套管狭窄处的切面，几乎未见斑块形成；而在套管正下游（C），振荡血流导致形成中等程度、更稳定类型的斑块（即脂质核心较少或无）。（C1, C2 = 套管的两个半壳，P = 斑块，星号 = 血管管腔）

讨论

为了尽量减少实验差异，建议使用年龄相近且饮食史相同的动物进行实验。最近发表的一项研究表明，在野生型小鼠中应用的剪切应力调节方法可能是研究内皮功能障碍以及由血流动力学改变诱导的早期炎症反应的良好模型¹³。然而，若要研究动脉粥样硬化斑块的形成，则需要使用转基因高脂血症小鼠模型（例如ApoE基因敲除小鼠）。在每种小鼠模型中，斑块沉积的进展程度取决于所采用的饮食类型。通常情况下，饮食中胆固醇/脂肪含量越高，疾病进展越迅速。

在套管植入过程中，外科医生应尽量减少组织损伤和操作，以降低因损伤引起的炎症反应。当研究重点为动脉粥样硬化过程中的炎症反应时，尽量减少损伤尤为重要。为了评估术后炎症的程度，强烈建议在部分动物中植入非缩窄性对照套管。对照套管应由相同材料制成，但具有连续且非缩窄的内径。

还必须始终将套管放置于颈动脉的相同位置，并始终选择同一侧，否则血流速度无法重复。当合并两个套管半壳时，手术者需特别注意套管的合适装配，因为装配不当会导致内腔无法形成理想的锥形结构，进而引起血流参数的不可预测。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
剪切应力改性剂（聚醚酮）	Promolding BV