多目标追踪是一种自制算法，用于追踪活细胞质膜中单个标记的分子。该算法能够高效地在高密度条件下随时间检测、估算和追踪分子，为研究纳米尺度的膜动力学提供了一种用户友好且全面的工具。
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摘要
摘要
我们的目标是全面描述在不同生物学功能中细胞膜上发生的分子过程。通过开发用于高密度单粒子追踪（Single-Particle Tracking，SPT）的专用分析工具——多重靶标示踪技术（Multiple-Target Tracing，MTT）1，我们致力于在单分子水平上表征细胞膜复杂的组织结构与动态行为。单分子视频显微技术具有毫秒级时间分辨率和纳米级空间分辨率1-11，能够通过精确定位细胞受体的位置、运动性、受限区域或相互作用等参数，对膜的组织结构进行详细刻画12-14。
我们从实验和算法两个方面重新审视了单粒子追踪技术（SPT）。实验方面包括优化实验装置和细胞标记，特别强调实现尽可能高的标记密度，以提供分子在膜内动态过程的实时动态快照。算法方面则涉及轨迹重建的每一步骤：峰点检测、定位估计与轨迹重连，这些问题通过图像分析领域的特定工具加以解决15,16。在检测后实施“消元”处理，可有效识别出最初被邻近较强峰点遮蔽的弱峰点。值得注意的是，提升检测精度可直接改善轨迹重连效果，减少轨迹中的断裂间隙。我们采用蒙特卡洛模拟，针对不同标记密度和噪声水平评估了该方法的性能，这些条件通常代表了在高时空分辨率下进行并行测量的两大主要限制因素。
利用连续的开/关光转换或非线性光学方法，对单个分子可实现纳米级精度17，从而获得详尽的观测结果。这构成了纳米显微技术（nanoscopy）方法17的基础，例如STORM18、PALM19,20、RESOLFT21和STED22,23，但这些方法通常需要对固定样品进行成像。其核心任务是检测并估测来自单个分子的衍射极限峰。因此，只要提供适当的假设条件（例如采用恒定的位置精度而非布朗运动），MTT可直接适用于纳米级分析。此外，MTT在本质上可应用于任意尺度：不仅可用于分子，也可用于细胞或动物等。因此，MTT是一种强大的追踪算法，在分子和细胞尺度上均具有广泛应用。
方案
在本视频中，我们展示了一个完整的单粒子追踪实验，使用靶向特定膜受体的量子点。该实验的主要目标是区分在活细胞质膜中测得的不同类型的分子扩散行为。实际上，膜上发生的分子运动通常会偏离布朗扩散，例如表现为线性定向运动或被限制在纳米结构域内26-29。我们力求在技术允许的范围内同时追踪尽可能多的受体，以获取活细胞膜内动态行为多样性的快照。这最终有望帮助解析调控细胞表面受体信号传导的机制。
1. 细胞培养
- 准备细胞样品：使用内源性表达表皮生长因子受体（EGFR）的贴壁COS-7细胞30。在无抗生素条件下处理活细胞时，必须始终采用适当的无菌技术，以确保不存在潜在的、难以检测的污染。
- 将细胞培养于完全培养基中（DMEM，含10%小牛血清、1%谷氨酰胺、1% HEPES和1%丙酮酸钠，具体试剂见下表），在37 °C、7% CO2条件下培养，并确保在接种至Lab-Tek培养板前细胞处于亚汇合状态并处于指数生长期。
- 实验前一天，将5,000个细胞/孔接种于8孔腔室载玻片（Lab-Tek）中，过夜培养。对细胞进行计数可确保细胞密度恒定，从而保证每个细胞所对应的量子点比例具有可重复性。
2. 细胞标记
制备具有特定包被的量子点。量子点是由半导体材料组成的荧光纳米颗粒。与传统的荧光探针相比，这些纳米颗粒具有极高的亮度和光稳定性31,32，因此可用于实现单分子成像所需的适当信噪比（SNR）。
- 实验前，通过木瓜蛋白酶消化杂交瘤细胞系（mAb 108，ATCC HB-9764）产生针对EGFR的Fab片段，方法如前所述21。
- 按照制造商说明将Fab与生物素偶联（EZ-link sulfo-NHS-LC-biotinylation Kit；Thermo Scientific，图1A）。
- 使用链霉亲和素功能化的量子点（Invitrogen），其发射波长为605 nm（该波长在亮度、检测灵敏度以及与细胞自发荧光分离方面均具有最佳性能）。
- 在完全培养基中配制标记溶液（见特异性试剂表），以饱和量子点周围的链霉亲和素位点，并防止量子点聚集以及非特异性结合至细胞或盖玻片。
- 配制两种中间溶液：一种含量子点-链霉亲和素，另一种含生物素化Fab，浓度均为20 nM。
- 将这两种溶液等体积混合：以1:1的比例混合量子点与Fab，获得最终工作浓度为10 nM的Fab:量子点复合物。采用等摩尔比有利于形成单功能化复合物，即每个量子点结合一个生物素化Fab片段，从而实现单价标记，减少因受体交联导致的假象观察33,34。
- 在25 °C下孵育15分钟，使用转速为每分钟1,200转的摇床以防止聚集。混合物随后即可用于活细胞标记。
- 在37 °C、7% CO2条件下，将细胞与100 μl上述混合液孵育5分钟。
- 使用预热至37 °C的无自发荧光成像培养基（HBSS缓冲液，1% HEPES，见特异性试剂表）洗涤细胞。
- 通过多次用成像培养基洗涤每个孔（通常在室温下洗涤5次，最后一次洗涤前至少间隔5分钟），小心去除多余的标记物，以避免未结合且失焦的量子点对信噪比造成不必要的干扰。
3. 光学装置
视频显微镜装置由四个主要部分组成：
- 配备特定荧光滤块（FF01-457/50 激发滤光片、FF495-Di02 二向色镜和 FF01-617/73 发射滤光片，Semrock）以及高数值孔径（1.3 或 1.49）油浸 100 倍物镜的倒置显微镜。
- 100 W 汞灯（通过光纤与显微镜耦合，避免干扰温度调控）。
- 具有 512 x 512 像素的高灵敏度 EMCCD 相机，以获得足够的信噪比。
- 培养箱，用于在实验期间将生物样品维持在 37 °C。
4. 数据采集
- 选择孤立且分布良好的细胞。这有利于形成平整、延展良好的片状伪足，最适合观察膜分子的平面运动。
- 通过透射光和荧光下的细胞形态评估其生理状态：囊泡运输活跃、无坏死或凋亡迹象、自发荧光较低，以及中等至强的量子点标记（通常每个细胞标记多达 1,000 个量子点，见 图 1B, C）。
- 选择高标记密度，这对于同时监测尽可能多的受体至关重要。该密度实际上受到生理因素（表面表达量、表位可及性、侧向运动）和算法参数（非重叠的点扩散函数（PSF），即使考虑因运动引起的模糊，仍需保证准确检测与轨迹重连）的共同限制。
- 对每个细胞，首先采集明场图像（如有条件，优先使用微分干涉差（DIC）），以便后续检查细胞形态及片状伪足的空间边界。
- 将该图像以与视频序列相同的名称保存（例如 cell1.tif 和 cell1.stk），并存放在名为 dic 的子文件夹中；按照此命名约定，算法可自动为每个视频序列匹配对应的明场图像。
- 每个细胞连续采集 1 至 3 段视频，通常以 36-ms 帧率采集，这是该相机在全帧模式下可达到的最快速率。然而，若使用具有更高灵敏度和/或更少像素的专用 CCD，也可提高采集频率，最高可达 1-ms 帧率。帧转移技术可实现帧间几乎无延迟。
- 电子倍增增益应始终设置为最大值（如适用，略低于饱和水平），以实现单分子检测灵敏度，并确保足够的信噪比，至少高于 20 dB（以实现有效的峰位检测1），通常在 25–30 dB 左右。
- 每段视频通常采集 300 帧，因为轨迹重建平均覆盖约 100 帧，主要受限于长时间的闪烁事件。视频的采集频率和时长可根据具体测量需求进行调整，例如需要更长轨迹时可相应延长。
5. MTT 分析
- 在 Matlab 或 Octave 中选择包含待评估视频文件的目录路径。
- 要启动完全自动化的分析1,35，请在 Octave 中输入命令 detect_reconnex23，或在 Matlab 中输入 MTT23i。该程序意为“2.3 版本，带用户界面”，可与之前的 2.2 版本一同下载。程序首先显示一个图形界面，列出所有使用的参数，如图 2所示。
6. 典型结果
MTT 可自动分析每段录制的视频，提供检测到的目标和估计目标的轨迹，并辅以进一步的分析，例如限制行为检测。这最终实现了将轨迹映射到细胞图像上（图 1C 和 3）。
MTT 描述
核心的MTT分析在每一帧上进行，涉及3项主要任务（图3）：
- 检测在以每个像素为中心的连续滑动子区域内，目标（量子点）是否存在，通过比较两种假设：存在信号（点扩散函数建模为二维高斯峰）或仅有噪声，使用一个阈值以确保足够低的误报率，每帧图像中假阳性检测少于一次。这将生成一张检测概率图。每个局部极大值被视为一个潜在目标，前提是其概率水平高于根据期望的误报概率（PFA）设定的最小值。该阈值设定得足够低，以有效区分信号与噪声，最大限度避免假阳性检测（默认PFA为10-6，以确保在512 × 512像素图像中误报少于一次），同时仍保持足够高的检测概率，达到理论预测的最优值1。需注意，使用子区域的要求意味着图像边界区域（默认7 × 7像素窗口下为3像素）无法被评估。
- 估计每个已检测目标的相关参数，例如亚像素位置和信号强度。对每个检测到的目标，进一步执行最小二乘高斯-牛顿拟合，以估计检测到的高斯峰的位置、宽度和高度。这尤其可提供染料的亚像素位置（在典型信噪比条件下，对于静止或缓慢扩散的染料，精度为10至20 nm；当染料扩散速率为0.1 μm2/s时，精度可降至约100 nm）。
- 重新连接新检测到的目标与此前各帧已建立的轨迹。将新目标集合与已有轨迹集合进行匹配。为此，在尽可能为每个目标分配轨迹时，会利用检测步骤中获得的所有可用统计信息，不仅包括位置，还包括强度、宽度、闪烁行为及其相关统计特征。因此，目标并非简单地分配给最近的轨迹：在轨迹交叉的情况下，将综合考虑强度、速度、宽度和闪烁特性。该方法提供统计上最优的重连评分。此策略尽可能避免将重连过程偏向最近邻轨迹。
若峰的估计或重连接失败，可事后拒绝该峰。一个特殊测试用于检测新峰，这将启动新的轨迹。该测试采用更严格的虚警概率（10-7），因为将峰重新连接至轨迹可被视为de facto对其相关性的验证（此标准按定义不适用于新峰）。
轨迹分析
接下来通过一个与局部扩散成反比的函数来评估可能的瞬时限制效应24-29。应用阈值可界定出是否存在限制区域或非限制区域。通过对所有轨迹重复此过程，我们能够以瞬时限制/减速事件的形式描绘膜动力学。该结果也可通过此限制指数的二进制值或离散值来表示。
默认情况下，MTT 会自动执行这些任务，并将 8 个峰值参数保存在一个文本文件中：每帧视频（7 行为一组）和每条轨迹（列）的帧编号、i 和 j 位置、信号强度、半径、偏移量和闪烁参数。这些输出参数可通过 Matlab 或 Octave 中的 fread_data_spt 脚本重新加载，以进一步分析轨迹或信号强度，附录中的 MTT_example 脚本 提供了示例。
进一步分析可获得每个细胞上的轨迹图（图 1C 和 3），并为相关参数（如峰值强度、信噪比或局部扩散值）提供直方图分布。对于每个文件，各参数的均值和标准差均保存在文本文件中，并附上直方图图像。对于对数分布（例如平方位移 r2），采用几何平均数。扩散系数 D 通过均方位移（MSD）曲线前五个点的线性拟合计算得出。这些数值可概括实验的整体情况，例如涉及细胞反应动力学或影响膜结构的药物/酶处理实验。由于 MTT 是开源代码，该功能可轻松适用于各种特定研究需求。
图1. 通过MTT监测膜受体动态。 （A）膜组分（如EGFR）被标记有与生物素化Fab片段偶联的量子点（各分子大致按比例绘制的示意图）。（B）从活体COS-7细胞获得的典型荧光图像，曝光时间为36毫秒，显示对应于单个标记受体的衍射极限光斑。（C）MTT分析输出结果，显示重建的受体轨迹叠加于细胞的明场图像上。
图2. MTT输入参数。 运行MTT23i将打开一个图形用户界面，列出所有输入参数、名称及默认值，如我们先前发表的文献1中所述。在算法中，空间和时间参数（搜索窗口、峰值半径、最大扩散和闪烁）采用无量纲标准单位，即像素和帧。校准可在事后应用，以转换输出结果。默认值对应于使用100倍放大倍率的Cascade 512BFT相机，其像素尺寸为：156 nm/pxl，帧间隔为：36 ms/frame。
研究人员应优化几个关键参数，例如预期的最大扩散系数（“Diff max”）和最大闪烁消失时间（“Toff”）。这两个空间和时间限制几乎是在特定实验条件下唯一需要重新考虑的参数，其余参数均已设置为稳健的默认值。例如，误报次数被直接设定为每百万像素少于一次错误，即每帧图像少于一次，这在大多数情况下已足够理想。所有参数均保存在输出文件夹中的一个文本文件内，以便用户后续核对分析所使用的具体设置。
图 3. MTT 分析的主要步骤。 从一组实验性的荧光图像堆栈开始，依次自动检测信号峰，并通过高斯拟合进行估算，随后在连续帧之间重新连接（流程图上部为第一阶段操作）。进一步可对所得轨迹分析其潜在的限制区域行为，例如最终生成相关描述参数的动态图谱（流程图下部为第二阶段操作）。
图 4. 标记价态不影响 MTT 分析结果。 为评估由人为多价标记引入的潜在偏差，采用 MTT 分析追踪使用两种不同标记策略标记的内源性 EGFR，并生成和分析其运动轨迹图。（A）受体使用生物素化 Fab 片段与量子点605-链霉亲和素进行标记，如实验方案所述。在此情况下，量子点与链霉亲和素的多价性可能导致多个受体连接至单个染料分子。（B）受体使用直接偶联有机染料 Atto647N 的 Fab 片段进行标记。在此情况下，一个 Fab 片段（即一个受体）可能偶联多个染料分子。（C）针对每种标记方式（左图：量子点标记；右图：Atto 染料标记），计算每个细胞所有轨迹的均方位移（MSD）曲线。扩散系数通过 MSD 前五个数据点的线性拟合计算得出（红色虚线）。两种标记策略得到的扩散系数值相似（中间图）。Qdot：量子点605（n = 5 个细胞），Atto：Atto647N（n = 7 个细胞），ns：无显著差异（Student t 检验 p 值 > 0.05）。
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讨论
在单粒子示踪技术中，除了细胞和显微镜相关方面，数据分析也是工作中相当重要的一部分。这涉及用于完成三个主要任务的算法：在每一帧中检测、估计并重新连接信号峰。但这项工作的关键之处在于算法本身的设计与完善，该算法可能需要针对任何新的特定研究进行调整，尤其是后续的附加步骤（例如解析运动模式、相互作用或化学计量比）。
然而，一旦算法完全开发完成，其运行过程就非常直接，尤其是因为我们致力于将输入参数的数量保持在最低限度（图3）。这使得MTT方法具有很强的稳健性且易于实施。在设计MTT时，我们的目标是彻底重新审视每个任务所采用的分析选项。我们希望从两个具有挑战性的方向上对整个流程进行优化：
- 高密度标记有助于在细胞表面采样方面提供详细的空间信息。理想情况下，应尽可能同时追踪几乎完整的分子群体，以实现全面的观察。然而，这种完全标记会导致图像类似于传统免疫荧光所获得的结果，无法达到单分子分辨率，因为所有标记由于衍射效应而严重重叠。对于典型的分子数量（即每个细胞约含105个受体30）和细胞尺寸（即...
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致谢
感谢我们的团队成员，特别是MC Blache提供的技术协助，以及M Irla和B Imhof给予的支持和富有成效的讨论。放气与限制示意图经《自然-方法》许可转载。本项目得到法国国家科学研究中心（CNRS）、法国国家健康与医学研究院（INSERM）和马赛大学的机构资助，以及普罗旺斯-阿尔卑斯-蓝色海岸大区、法国国家癌症研究所、法国国家科研署（ANR-08-PCVI-0034-02，ANR 2010 BLAN 1214 01）和法国医学研究基金会（FRM-2009认证研究团队）的专项资助。VR获得法国抗癌联盟博士后奖学金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Cos-7 细胞系 | ATCC | CRL-1651 | 5,000 个细胞/孔 |
| 无钙 HBSS2+ | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 14175 | 1 ml |
| 0.05% 胰蛋白酶 EDTA | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 25300 | 1 ml |
| 8孔盖玻片培养皿 | Nalge Nunc international | 155441 | 1 |
| QDot-605 链霉亲和素 | Invitrogen | Q10101MP | 20 mM |
| 生物素化Fab片段 （Fab 段合成方法见参考文献） 21) | |||
| mAb 108 的 Fab 片段 | ATCC | HB-9764 | 200 μg |
| NHS-生物素 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21435 | 18.5 μg |
| 完全培养基 | |||
| DMEM | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 41965 | 500 ml |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F7524 | 50 ml |
| L-谷氨酰胺 | GIBCO，Life Technologies 公司产品 | 25030 | 5 ml |
| HEPES | GIBCO，Life Technologies 公司产品 | 15630 | 5 ml |
| 丙酮酸钠 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 11360 | 5 ml |
| 成像介质 | |||
| 含钙 HBSS2+ | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 14025 | 25 ml |
| HEPES | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 15630 | 250 μl |
| 倒置显微镜 | 尼康仪器 | Eclipse TE2000U | |
| 荧光灯 | 尼康仪器 | Intensilight C-HGFIE | |
| 1.3 数值孔径 100倍物镜 | Nikon Instruments | Plan Fluor 1.30 | |
| 1.49 数值孔径 100倍物镜 | 尼康仪器 | APO TIRF 1.49 | |
| 相机 | Roper Scientific | Cascade 512 B | |
| 恒温箱 | 生命成像服务 | 方框 | |
| 附录：MTT补充分析示例脚本 | |||
| 功能 MTT_example(文件名) %%% 恢复 MTT 输出结果的基本示例 %%% 绘制每条轨迹并构建直方图 荧光强度的百分比 | |||
| 如果 nargin&<1% 未提供文件名？ files = dir('*.stk'); 如果 isempty(files)，显示('当前目录中无数据') 返回，结束 file_name = files(1).name; % 默认：第一个 stk 文件 默认使用 file_name 结束 | |||
| file_param = [file_name '_tab_param.dat']; % 输出文件 | |||
| %% 加载数据 cd('output23') % 或者 (‘output22')，根据所使用的版本 % 免责声明：2.2 版本仅生成 7 个参数， % 一个额外的参数 noise 已在版本 2.3 中添加 | |||
| % 一次性在单个表格中读取所有参数 % tab_param = fread_all_param(file_param); % tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = ... | |||
| % 将所有参数（除 frame_number 外）读入单独的表格中 % [tab_i, tab_j, tab_alpha, tab_radius, tab_offset, tab_blk, tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param); | |||
| tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % 索引为3，因为轨迹编号 && 帧编号，无信息量，将被舍弃！ tab_j = fread_data_spt(file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8); | |||
| %% 遍历轨迹 N_traces = size(tab_i,1); % 表格为 N_traces 行 × N_frames 列 | |||
| 用于 itrc = 1:N_traces No_blk_index = tab_blk(itrc, :)&大于0 % 仅非闪烁步骤 plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index)) xlabel('i（像素）')，ylabel('j（像素）') 轨迹 # itrc 按任意键继续显示下一条轨迹 结束 | |||
| %% 荧光直方图 N_datapoints = sum(tab_blk(:))&>0 % 仅非闪烁步骤 hist(tab_alpha(tab_blk>0), 2*sqrt(N_datapoints) % 使用 2sqrt(N) 个区间 xlabel('强度（a.u.）'), ylabel('出现频次') 粒子荧光强度直方图 |
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